七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

七彩神仙鱼催乳素基因的克隆、定位及表达分析

【目的】七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciatus）具有特殊的亲代抚育行为,克隆并定位七彩神仙鱼催乳素基因,分析其在亲代抚育中的表达模式,为理解催乳素在七彩神仙鱼亲代抚育中的作用提供依据。【方法】通过 BLASTP 对七彩神仙鱼全基因组进行分析,鉴定出 1 个催乳素基因,命名为 dfprl。基于 dfprl 基因的 CDS 区,设计克隆和 PCR 引物,通过 RACE 技术克隆获得 dfprl 基因全长,并利用生物信息学对 dfprl 基因进行结构分析,对其氨基酸序列进行理化性质和进化分析。对不同抚育阶段七彩神仙鱼的脑、性腺和皮肤进行转录组分析,探究dfprl 基因在亲代抚育中的表达特征,并利用原位杂交技术对 dfprl 基因在七彩神仙鱼皮肤中的表达进行定位。【结果】dfprl 全长为 1 282 bp,cDNA 序列开放阅读框长度为 639 bp,共编码 212 个氨基酸,5''-UTR 为 309 bp,3''-UTR 为334 bp。dfprl 蛋白存在 PRL 家族的典型结构域 Hormone_1,dfprl 蛋白与慈鲷科其他鱼类 PRL 蛋白相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼（Archocentrus centrarchus）对应的氨基酸序列同源性最高、为 96.70%。亲鱼进入抚育阶段后,dfprl 在性腺和皮肤中的表达水平逐渐上升,抚育结束时表达水平下降。原位杂交结果显示,dfprl 在皮肤粘液细胞中表达,且与七彩神仙鱼催乳素受体（dfprlr）表达位点重叠,在抚育早期阶段高表达。【结论】七彩神仙鱼 dfprl基因高度保守,存在稳定的 Hormone_1 结构域。七彩神仙鱼 dfprl 基因在亲代抚育阶段的皮肤中高表达,且在亲代抚育阶段的皮肤粘液细胞中与 dfprlr 表达位点重合,表明 dfprl 可能通过作用于 dfprlr 进而促进七彩神仙鱼独特抚育行为的发生。     

七彩神仙鱼同工酶表达的组织差异性分析

运用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳法,对七彩神仙鱼的8种组织(脑、皮肤、肌肉、肝脏、胰脏、鳃、眼球晶状体、心脏)中的9种酶类[酯酶(EST)、醇脱氢酶(ADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、山梨醇脱氢酶(SDH)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)和酪氨酸酶(COX)]进行了研究,并对其各组织中的同工酶位点及其酶谱表型进行了分析。试验中共检测到29个基因座位,分别由相应的等位基因决定。试验结果表明,七彩神仙鱼的9种同工酶系在各组织都显示出清晰稳定的酶谱,除CAT在七彩神仙鱼各组织和个体中表现一致以外,其它8种同工酶都存在明显的组织差异性和一定的个体差异,组织差异与其生理功能相一致。肝脏和胰脏中的同工酶位点信息丰富,肝脏中的EST和ADH表达活跃;肝脏和眼中的LDH存在C位点,且眼球晶状体中的C位点存在和A、B位点杂合的情况。     

七彩神仙鱼工厂化养殖技术

为促进七彩神仙鱼产业转型发展,现以上海某七彩神仙鱼养殖场开展七彩神仙鱼工厂化养殖为例,从工厂化养殖设施、养殖水处理、放养前的准备、苗种放养、投饵管理、水质管理、疾病防治、分级筛选、周转缸管理和打包运输等方面总结介绍七彩神仙鱼工厂化养殖技术,供广大七彩神仙鱼养殖者参考借鉴。     

七彩神仙鱼的繁殖技术要点

七彩神仙鱼原产亚马逊河流域的平静小河中,是一种较高贵的观赏鱼.但它的人工繁殖技术却有一定难度,下面将作者近年来的繁殖经验简介如下:     

七彩神仙鱼

原产地区南美亚马逊河流域。形态特征和习性头尾长10厘米～15厘米,尾柄很短。背鳍从头后背部开始,臀鳍从相对的腹鳍后面开始直达尾鳍基部。尾鳍外缘弧形。体色基调茶褐色,散布着8条间距均匀的蓝黑色垂直条纹。头背和背鳍、臀鳍、腹鳍上有天蓝色条纹,鳍外缘布满橙红色、白色斑点和细纹,这些色彩随光线的强弱而发生变化,光暗,色彩也暗,经强光照射后,色彩明亮夺目,且颜色增多。七彩神仙鱼最佳生长环境水温为25℃～28℃,水质清洁,pH6.2～6.8的弱酸性软水,水中有阔叶水草生长和光照。喜食水蚯蚓、孑孓和鱼虫等天然饵料。七彩神仙鱼性格孤僻,不爱…     

七彩神仙鱼脑组织转录组mRNAs差异表达分析

[目的]挖掘七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)脑组织性别差异基因,为揭示脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制打下基础.[方法]利用Illumina HiSeq 6000测序平台对七彩神仙鱼雌、雄脑组织样本进行转录组测序分析,经过滤和Trinity组装获得基因,采用DIAMOND进行功能注释;并选取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和egg-NOG等数据库进行比对,筛选出差异表达候选基因;随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证.[结果]从构建的七彩神仙鱼脑组织cDNA文库测序获得337190200条原始数据(Raw reads),经质量筛选后获得34109个基因(平均长度1007.00 bp)和67488个转录本(平均长度694.00 bp).经生物信息学分析方法筛选,最终获得85个差异表达基因(61个在雄鱼脑组织中高表达,24个在雌鱼脑组织中高表达),包括黑色素浓集激素(MCH)、催乳素释放激素(Prlh)、垂体同源结构域转录因子2(pitx2)、免疫球蛋白家族成员(DSCAM和IGDCC3)、溶质载体(UNC93B1)及醛糖还原酶(AKR1B1)等功能基因.与雌鱼脑组织相比,雄鱼脑组织中涉及细胞突触传递、激素调控、信号传导、黑色素浓集激素、催乳素释放激素、生长激素和G蛋白偶联受体的基因呈下调趋势,而涉及离子运输和免疫反应的基因呈上调趋势.随机选取6个差异表达基因(Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP)进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌鱼脑组织的相对表达量较高,而CRP基因在雄鱼脑组织的相对表达量较高.[结论]MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙鱼脑组织中呈性别差异表达,可能在调节脑组织类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用,可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究.     

人工养殖七彩神仙鱼性腺发育的研究

七彩神仙鱼是一种名贵的观赏鱼,近年来市场需求量不断增加,研究其性腺发育规律将为该鱼的人工繁殖研究提供理论依据.对人工养殖七彩神仙鱼的性腺发育进行了形态学观察,并通过常规石蜡切片对其性腺发育进行了组织学观察.结果表明,七彩神仙鱼的卵巢发育可分为6期,卵子的发生可划分为5个时相.卵巢中卵母细胞的发育存在高度不同步性,这与其分批非同步产卵的特点相一致.人工养殖条件下,9月龄雌鱼的卵巢可发育到第Ⅳ期,达到性成熟.七彩神仙鱼的精巢为小叶型.精巢发育也可分为6期,精子的发生经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子5个阶段.人工养殖条件下,10月龄雄鱼的精巢可发育到第Ⅴ期,达到性成熟.雌鱼的性成熟比雄鱼早1个月.七彩神仙鱼经过多代人工驯化饲养后雌鱼的繁殖能力有所增强.     

Vasa基因在斑马鱼不同发育时期的mRNA 表达分析

Vasa基因在果蝇中首次报道后,作为不同物种早期原始生殖细胞(PGC)标记基因被普遍接受.但对其研究都集中于早期胚胎,对性腺分化及成熟时期的Vasa表达及功能少有研究.RT-PCR结果显示,Vasa基因在整个发育阶段的表达量先上升再下降.荧光定量PCR结果显示,在同一发育时期,精巢、卵巢表达量基本一致,卵巢略高于精巢.mRNA原位杂交显示,Vasa基因早期在斑马鱼生殖干细胞特异表达,随后在精巢表达于精原细胞和初级精母细胞,在卵巢表达于Ⅲ、Ⅳ、V时相卵母细胞.研究结果有助于鉴定斑马鱼生殖干细胞和进一步研究性分化和逆转的细胞机制.     

七彩神仙鱼皮肤色素细胞观察及类胡萝卜素组分分析

观察了黄白、红点绿和红盖子七彩神仙鱼皮肤色素细胞的分布情况,并通过光谱、色谱和类胡萝卜素显色反应等方法分析了其皮肤类胡萝卜索的组成成分.黄白七彩神仙鱼体侧皮肤以黄色素细胞为主并有少量黑色素细胞,皮肤类胡萝卜素主要为黄体素;红盖子七彩神仙鱼体侧皮肤以红色素细胞和黄色素细胞为主,也有一定量的黑色素细胞和虹彩细胞;红点绿七彩神仙鱼在皮肤红色区又大量的红色素细胞、黄色素细胞和黑色素细胞,而在蓝条纹区有大量虹彩细胞和黑色素细胞.红点绿和红盖子七彩神仙鱼皮肤色素组成均为虾青素及其酯、角黄素、玉米黄素的酯及α-胡萝卜素.     

仿刺参ghitm基因的克隆及LPS诱导后的表达分析

根据GenBank中登录的仿刺参Apostichopus japonicus ghitm基因的EST片段,采用RACE扩增法克隆了仿刺参ghitm基因的cDNA全长序列,并利用qRT-PCR技术检测了经LPS诱导后仿刺参ghitm的表达变化情况。结果表明：仿刺参ghitm基因( Aj-ghitm)的cDNA序列全长为1325 bp,包含一个1005 bp编码334个氨基酸的开放阅读框,序列两端分别为140 bp的5’UTR和180 bp的3’UTR。序列分析结果显示, Aj-ghitm编码的蛋白含有一个8次跨膜结构域,与GenBank中登录的紫色球海胆GHITM蛋白的氨基酸序列相似度为65·4%,且在系统发育树中聚为一支; qRT-PCR检测结果表明,经LPS刺激可诱导仿刺参体腔细胞Aj-ghitm mRNA的表达且呈先下降后升高最后回复到接近正常水平的趋势,在24 h时上升到最高,随后下降。本研究是有关棘皮动物ghitm基因的首次报道,其结果可为进一步探讨ghitm在仿刺参抗细菌感染以及生长发育等方面的功能及作用机制提供参考。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆VvGW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物.采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆.利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式.结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为VvGW2基因.VvGW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68.该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型.与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47％ ～53％.根据VvGW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类.实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,VvGW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高.不同葡萄品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低.表明VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关.     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

亚麻MAPK基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析

为研究MAPK基因与亚麻应答盐碱胁迫的关系,利用生物信息学方法从亚麻基因组中预测得到20个亚麻MAPK基因,命名为Lu MPK1~Lu MPK20,这20个MAPK基因都含有T[D/E]Y保守结构域,除Lu MPK5和Lu MPK20以外,其他基因都是两两一组。利用PCR技术克隆得到5个亚麻MAPK基因(Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16),这5个基因序列与预测序列完全一致。利用数字基因表达谱数据,分析亚麻盐碱胁迫下这5个基因的表达情况。结果表明,这5个基因的表达均受到盐碱胁迫影响。Lu MPK3、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16在中性盐胁迫下上调表达,Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14在碱性盐胁迫下上调表达,Lu MPK16在碱性盐胁迫下下调表达。研究为亚麻MAPK基因功能,尤其是耐盐碱功能研究奠定理论基础。     

鸡HOPX基因的克隆及表达分析

前期研究发现,HOPX基因在鸡脂肪组织高表达,为了解该基因在脂肪发育过程中的作用,采用RT-PCR方法,扩增和克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并进行序列分析;采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法,开展了HOPX基因的组织表达谱分析、HOPX基因在东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系脂肪组织发育过程中的表达差异分析以及鸡脂肪细胞分化过程中的表达分析。研究结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区为222 bp,编码73个氨基酸。HOPX基因在鸡的多种组织中表达,其中,在脂肪组织中的表达量最高;在高、低脂系肉鸡的脂肪组织生长发育过程中,HOPX基因的表达均随年龄增长而上升,且高脂系鸡HOPX基因的表达量高于低脂系;在鸡脂肪细胞分化过程中,HOPX基因的表达呈上升趋势。HOPX基因的表达分析结果提示,该基因在鸡脂肪组织生长发育过程中发挥作用。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。