番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长eDNA序列为信息探针,筛选NCBI番茄EST数据库,依据同源EST信息,经人工拼接、RT—PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SISAMDC1（GenBank登录号：EF550528）,并利用染色体步移技术克隆了879bp的上游调控区域。SISAMDC1 eDNA序列全长1847bp,5′-UTR和3′-UTR分别长523和241bp;存在3个ORF（微型uORF、小型uORF和主ORF）,主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SISAMDC1基因组序列全长3648bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SISAMDCl基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SISAM-DCl基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SISMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W—box、TATA—box、CAAT—box等。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因上游序列的克隆和分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(sahh)全长序列设计两个嵌套引物,与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR扩增,得到sahh上游调控序列,通过序列分析发现,该序列含有1个TATA盒和4个CAAT盒.应用MatInspector程序分析sahh上游调控序列,发现该区域存在1个耐盐因子,1个热激因子,2个DRE元件和2个ABA应答元件.     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的草菇冷诱导基因Cor3功能验证

将草菇(Volvariella volvacea)冷诱导基因Cor3cDNA序列经EcoR I酶切克隆到原核表达载体pPROK-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、分离纯化发现该蛋白的分子量约为43kD,等电聚焦电泳结果表明,该蛋白的等电点为6.1,HPLC检测说明合成方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟4.5μmol,DNTB与同型半胱氨酸颜色反应测定水解方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟0.7μmol,根据上述特性可以确定草菇冷诱导基因Cor3所编码的蛋白是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。     

黄瓜CsPAP-fib基因的克隆与序列分析

以温敏型黄瓜‘C09-123’为试材,通过对不同夜温处理的黄瓜幼叶进行差异蛋白质鉴定,筛选出一个与低夜温影响黄瓜雌性形成密切相关的蛋白,采用生物信息学方法,对该蛋白进行生物信息学分析,并运用基因克隆技术克隆了该基因,以期为明确该基因在黄瓜性别分化中的作用机制奠定基础,也为进一步试验研究提供基因材料。结果表明:该基因全长870bp,编码289个氨基酸,该基因编码的蛋白质属于叶绿体中一个不稳定的疏水蛋白质,无明显信号肽,无跨膜结构。与甜瓜为同一进化分支,同源性较高。该蛋白属于PAPfibrillin蛋白家族,因此将编码该蛋白的基因命名为CsPAP-fib。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

番茄PG基因启动子的序列分析

以"中蔬四号"番茄为试材,利用PCR技术从"中蔬四号"番茄中扩增出1 500bp的PG基因启动子,并对启动子序列进行了生物信息学分析。结合PLANTCARE和PLACE数据库Database预测分析PG启动子。结果表明:PG启动子具有多个典型的TATA-Box和CAATBox等基本元件,以及光响应元件、热响应元件、乙烯响应元件、植物组织特异调控元件、胚乳表达相关调控元件、逆境胁迫响应元件、生理昼夜节律控制元件等,说明番茄PG基因的表达与光、温度、激素、逆境等因素有关,为以后深入研究PG基因的调控等研究提供理论基础。     

杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP鉴定

 为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源（E-Value<10^-5）,功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

桂花SVP同源基因的克隆及序列分析

试验以桂花‘日香桂'Osmanthus fragrans cv.rixianggui嫩叶为试验材料,根据转录组数据库中SVP基因的保守序列信息,通过PCR方法克隆得到日香桂SVP基因,将其命名为QfSVP,运用在线生物信息学分析工具对OfSVP序列进行分析。结果表明:OfSVP基因全长1325bp,开放阅读框(ORF)为687bp,编码228个氨基酸。氨基酸序列保守性分析发现,OfSVP所编码的蛋白中含有MADS-box基因家族特有的K-box区域。通过ProtParam ExPASy在线软件分析OfSVP蛋白质分子式为C1121H1859N327O364S9,分子量为26030.60Da,理论等电点PI值为5.80。不稳定指数为68.10,属于不稳定蛋白质。蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明OfSVP与油橄榄(Olea europaea)、黄连(Coptis chinensis)和芝麻(Sesamum indicum)的同源性分别达到94%、83%和82%;OfSVP基因的克隆与序列分析对于进一步了解桂花'日香桂'成花机理具有重要意义。     

番茄漆酶基因LeLACmiR397的克隆与表达分析

通过BLAST分析,获得了番茄漆酶（Laccase,LAC）基因相关的15个EST片段,并对这些EST进行了同源比较和序列拼接,得到1个含有小分子RNA miR397识别位点的LAC片段,命名为LeLACmiR397。根据蛋白质结构域推测,LeLACmiR397蛋白存在1个Cu–氧化酶结构域。LeLACmiR397时空表达分析表明,其在番茄根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达,而在叶中不表达。根据该片段的核苷酸序列信息进行5′-和3′-RACE扩增,得到了番茄LAC基因的全长cDNA（LeLACmiR397,登录号EU503151）,其在番茄基因组中对应的基因为Solyc07g049460.2.1。通过在番茄中过表达miR397a基因,发现转基因番茄中LeLACmiR397表达量降低,同时其PPO、POD、SOD含量也有所下降。用丁香酸和芥子酸处理转基因植株幼苗,其根系比非转基因植株更长,抗性增强,表明LeLACmiR397与番茄植株的抗性反应有关。     

水茄泛素结合酶E2基因StUBCc的克隆及黄萎病菌诱导表达分析

以茄子近缘野生种水茄（Solanum torvum Swartz）幼苗根部为试材,并以黄萎病菌（大丽轮枝菌,Verticillium dahliae Kleb）处理的水茄的抑制差减文库中差异表达的EST片段F290为基础,利用RACE技术,获得一个756 bp的cDNA全长序列。经生物信息学分析发现该序列为泛素结合酶E2-2（UBC2）载体蛋白同源基因,命名为StUBCc,GenBank登录号为KP330492。StUBCc基因编码区共459 bp,编码152个氨基酸,该蛋白分子量为63.0925 kD,等电点为5.13。采用MEGA 5软件对StUBCc和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明其与葡萄的同源蛋白一致性最高,达99%,有很高的功能区段保守性。采用荧光定量PCR对黄萎病菌侵染不同时间的水茄幼苗根部StUBCc基因的表达量进行测定,发现在侵染6 h后,表达量最高,为对照（无菌水处理）的6.79倍。     

斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈gpd基因长2 724 bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15 kD、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。     

番茄雄性不育研究进展

番茄因其口感独特、营养丰富、适应力强,广受众人喜爱。其杂交优势明显,利用植物雄性不育育种可降低制种成本、缩短育种时间、提高制种效率和种子纯度。该研究阐述了番茄雄性不育的分类、影响番茄雄性不育的因素,探讨了番茄雄性不育的利用和遗传育种上所遇到的问题,以期为番茄雄性不育育种研究提供参考依据。