斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

草地贪夜蛾和斜纹夜蛾幼虫体内保护酶及解毒酶对2种杀虫剂的响应比较

【目的】明确草地贪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）]及其近缘种斜纹夜蛾[Spodoptera litura（Fabricius）]幼虫体内保护酶和解毒酶对2种不同作用类型杀虫剂的响应,为草地贪夜蛾和斜纹夜蛾的田间防控及抗药性治理提供科学依据。【方法】采用叶片浸渍法测定甲维盐和氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾和斜纹夜蛾3龄幼虫的毒力,并用2种杀虫剂亚致死浓度（LC₂₅）和致死中浓度（LC₅₀）处理过的小麦叶片分别饲喂2种害虫的3龄幼虫,比较取食6、12、18、24和48 h后幼虫体内保护酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）]及解毒酶[谷胱甘肽S-转移酶（GST）、细胞色素P450（CYP450）和羧酸酯酶（CarE）]的活性变化。【结果】甲维盐对草地贪夜蛾和斜纹夜蛾的毒力高于氯虫苯甲酰胺。2类杀虫剂胁迫下2种害虫的CYP450活性均上升,且草地贪夜蛾的CYP450活性高于斜纹夜蛾,在甲维盐和氯虫苯甲酰胺低剂量（LC₂₅）胁迫下草地贪夜蛾的CYP450活性均高于高剂量（LC₅₀）胁迫处理,处理后48 h均达最高值（15.72±0.41和15.36±0.47 ng/mL）;而草地贪夜蛾另2种解毒酶（GST和CarE）活性在甲维盐处理后低于斜纹夜蛾。甲维盐胁迫下2种害虫体内保护酶（SOD和POD）活性均降低,且草地贪夜蛾保护酶活性低于斜纹夜蛾;氯虫苯甲酰胺胁迫下草地贪夜蛾保护酶（SOD和POD）活性均上升,高剂量氯虫苯甲酰胺胁迫下2种害虫SOD和CAT活性均高于低剂量胁迫处理,且草地贪夜蛾SOD和CAT活性高于斜纹夜蛾。2种害虫体内保护酶和解毒酶活性对2类杀虫剂响应差异明显,且物种、药剂、浓度、时间、物种×浓度和药剂×浓度因素对2种害虫保护酶和解毒酶活性均有极显著影响（P<0.01）。2类杀虫剂胁迫下2种害虫的SOD和CAT活性间相关性较强。【结论】草地贪夜蛾对甲维盐的敏感性高于斜纹夜蛾,而对氯虫苯甲酰胺的敏感性低于斜纹夜蛾,且2种害虫均主要通过增强CYP450活性对杀虫剂进行解毒代谢。农业生产上推荐使用甲维盐作为防治草地贪夜蛾的药剂。     

斜纹夜蛾溴氰菊酯抗性和敏感品系酯酶的生化特性研究

测定了斜纹夜蛾酯酶的动力学参数,酯酶同工酶电泳和杀虫剂(溴氰菊酯和丙溴磷)对酯酶的抑制效应。结果表明,抗性品系与敏感品系酯酶的Km值之间均没有显著差异,但抗性品系酯酶的Vmax值比敏感品系的高且差异显著。在酯酶的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中,抗性品系中所含的酯酶同工酶条带数比敏感品系的多;溴氰菊酯浓度在12.5μmol/L时,对敏感品系酯酶的抑制率最大,约为30%,而对抗性品系酯酶的抑制率则随着溴氰菊酯浓度的升高而升高,溴氰菊酯浓度在50μmol/L时抑制率最大,约为75%;但是丙溴磷对抗、感品系的酯酶的抑制效应较为一致。上述结果说明在抗性品系中出现了与敏感品系不同的酯酶同工酶,但这些同工酶并没有显著改变抗性品系全酯酶的Km值,仅是增强了其酯酶活性,提高了对溴氰菊酯的代谢能力。     

斜纹夜蛾的抗药性及其治理策略

分析了斜纹夜蛾的抗药性特点、现状及其抗药性机理,提出了斜纹夜蛾的抗药性治理策略。     

江淮地区斜纹夜蛾对杀虫剂的抗药性测定

采用点滴法测定了江淮地区斜纹夜蛾对杀虫剂的抗性。结果表明,斜纹夜蛾对高效氯氰菊酯杀虫剂的抗性倍数最高,为42倍,达到高抗水平;对三唑磷和硫丹杀虫剂的抗性水平处于低水平抗性阶段,抗性倍数最高仅为7.5和8.8倍。     

斜纹夜蛾对15种杀虫剂的抗药性监测

为明确海南地区斜纹夜蛾对农业生产上主推及新型杀虫剂的抗性水平,本文采用叶片浸渍法测定了15种杀虫剂对斜纹夜蛾敏感种群和田间种群的室内毒力。结果表明,斜纹夜蛾对苏云金杆菌（ Bt）、阿维菌素产生了极高水平的抗性,抗性倍数分别为196．15和183．28倍;对毒死蜱、高效氯氰菊酯、茚虫威产生了高水平的抗性,抗性倍数分别为114．89、85．88和73．20倍;对乙基多杀菌素产生了中等水平的抗性,抗性倍数为10．56倍;对氰氟虫腙、甲维盐为低水平抗性,抗性倍数分别为6．95和6．21倍;对虫螨腈、甲氧虫酰肼的敏感性降低,抗性倍数分别为4．96和4．37倍;对溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺、丁醚脲、虱螨脲等均未产生明显的抗性。根据海南地区抗性监测的结果,提出了相应的抗性治理策略。     

植物次生代谢物质对草地贪夜蛾解毒酶活性及相关基因表达的影响

为探究草地贪夜蛾对毒害物质的反防御策略.以添加0.5％烟碱、0.05％黄酮、0.5％棉酚、0.01％水杨酸、0.1％香豆素5种植物次生代谢物质的人工饲料进行饲养草地贪夜蛾5龄幼虫,48 h后分别测定草地贪夜蛾中肠和脂肪体的谷胱甘肽-S-转移酶等4种酶的活性,同时采用半定量RT-PCR方法检测CYP4L13、CYP4M1...     

云南玉溪烟区烟草蚜虫对植物源农药的敏感性及其解毒酶活力比较

应用喷雾法测定了采自云南省玉溪市新平县新化乡和峨山县岔河乡的烟草蚜虫种群对6种植物源杀虫剂的毒力,并比较了2个烟蚜种群的3种主要解毒代谢酶活力、乙酰胆碱酯酶活力。结果表明,峨山县岔河乡烟蚜对植物源杀虫剂的敏感性高于新平县新化乡的烟蚜,其中0.5%藜芦碱可溶液剂、1.5%苦参碱可溶液剂、0.3%苦参碱水剂、1%苦皮藤素水乳剂、2%除虫菊素水乳剂、除虫菊浸膏对新平县新化乡和峨山县岔河乡烟蚜的毒力比分别为1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037;在高浓度处理下,6种植物源杀虫剂对峨山县岔河乡、新平县新化乡烟蚜的室内盆栽药效存在显著性差异;0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂、1.5%苦参碱可溶液剂、1.0%苦皮藤素水乳剂、0.3%苦参碱小剂在浓度不低于1 125 m L/hm2时,可有效防治峨山县岔河乡烟蚜,0.5%藜芦碱可溶液剂、2.0%除虫菊素水乳剂在浓度不低于2 250 m L/hm2时,可有效防治新平县新化乡烟蚜;2个地区烟蚜的谷胱甘肽S-转移酶比活力有显著差异,而羧酸酯酶、细胞色素P450单加氧酶、乙酰胆碱酯酶的比活力差异不显著。由结果可知,云南省玉溪市峨山县岔河乡和新平县新化乡烟蚜对6种植物源杀虫剂的敏感性存在显著差异,但羧酸酯酶、P450单加氧酶和乙酰胆碱酯酶3种解毒酶差异不显著,研究结果可为使用植物源杀虫剂防治烟蚜提供科学依据。     

沿江地区斜纹夜蛾暴发原因及控制技术

斜纹夜蛾是我市常发性主要害虫,对蔬菜及经济作物常造成严重危害。通过数年研究,明确了其发生规律、生态习性和暴发成灾特点,积极开展了预测预报,提出了最佳防治适期,形成了切实可行的配套综合控制技术,及时指导菜农开展适期防治,有效地控制了斜纹夜蛾的发生危害,经济效益显著增加。     

核型多角体病毒对斜纹夜蛾两种酶活性的影响

对感染核型多角体病毒的斜纹夜蛾(Spodoptera lituta)幼虫血淋巴酯酶和酚氧化酶进行了电泳分析,结果表明,两种酶的谱带在感染病毒后12h发生了明显的变化,导致酶带位移和新酶带的产生,在虫体内建立了新的酶系统;酚氧化酶比活性在感染核型多角体病毒后12 h最低,48h达到最高点.     

斜纹夜蛾抗溴氰菊酯品系的相对适合度和抗性遗传方式研究

通过构建种群生命表,观察比较了斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fab.)对溴氰菊酯抗性品系(R)和敏感性品系(S)的一系列生长发育和繁殖特征,以种群数量趋势指数来确定各个品系的生物适合度;并采用剂量对数-死亡机率值回归线(LD-P线)分析法,研究了斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗性遗传规律。结果表明,抗性品系(R)在产卵量、孵化率、幼虫历期和蛹重等方面与敏感品系(S)相比,表现出一定程度的生长发育和繁殖上的不利性,抗性品系的相对适合度是敏感品系的0.58。斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗性为常染色体多基因遗传;正、反交后代的显性度分别为0.47和0.45,抗性遗传为不完全显性。     

斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达

【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因,分析其序列特征,为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术,在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树,并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,登录号为HQ896486.1。序列分析表明,该基因cDNA全长829 bp,开放阅读框长519 bp,编码含172个氨基酸的蛋白,蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明,斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族,与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP,在大肠杆菌中表达重组蛋白,确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件,在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。     

斜纹夜蛾对甲氧虫酰肼的抗性选育及抗性风险评估

在室内用甲氧虫酰肼对斜纹夜蛾进行了抗性选育,并研究了斜纹夜蛾对甲氧虫酰肼的抗性现实遗传力和抗性风险.结果表明:经过12代9次选育,斜纹夜蛾对甲氧虫酰肼抗性发展缓慢,与选育前相比敏感性降低3.95倍,斜纹夜蛾对甲氧虫酰肼的抗性现实遗传力为0.119 9;在致死率为50%～90%的筛选压力下,要获得10.00倍抗性,需要8～18代,表明斜纹夜蛾对甲氧虫酰肼产生抗性的风险很小.     

氯氟氰菊酯对斜纹夜蛾抗性和敏感种群表皮穿透比较

 【目的】研究证实斜纹夜蛾对氯氟氰菊酯的抗性是否与其表皮穿透率降低有关。【方法】分别采用点滴法、浸叶法和叶片夹毒法测定了斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）对氯氟氰菊酯的抗性,用14C标记氯氟氰菊酯测定了斜纹夜蛾抗性和敏感种群3龄和5龄幼虫的表皮穿透率。【结果】采用3种方法测定结果表明,3龄幼虫抗性水平的次序为点滴法（抗性倍数为2 765.4倍）＞浸叶法（365.1倍）＞叶片夹毒法（34.0倍）,点滴法、浸叶法及叶片夹毒法间抗性倍数之比依次为81.3﹕10.7﹕1;5龄幼虫抗性水平的次序为点滴法（抗性倍数为2 271.3倍）＞浸叶法（257.2倍）＞叶片夹毒法（20.2倍）,点滴法、浸叶法及叶片夹毒法间抗性倍数之比依次为112.4﹕12.7﹕1。经穿透昆虫表皮的触杀毒力所引起的抗性高于经口器和表皮进入的胃毒毒力和触杀毒力之和所引起的抗性,更明显高于经口器进入的胃毒毒力所引起的抗性。同位素标记氯氟氰菊酯测定结果表明,处理后0.5 h和1.0 h,抗性种群和敏感种群间表皮穿透率差异不显著,处理后2 h,两种群间的穿透率存在明显差异,至处理后8 h,敏感种群3龄和5龄幼虫的表皮穿透率分别为46.3%和43.3%,抗性种群3龄和5龄幼虫的表皮穿透率分别为35.7%和29.1%,氯氟氰菊酯对抗性种群3龄幼虫的表皮穿透率仅为敏感种群幼虫穿透率的0.77倍,对5龄幼虫的表皮穿透率仅为敏感种群幼虫穿透率的0.67倍,抗性种群的穿透率明显慢于敏感种群的穿透率。【结论】斜纹夜蛾抗性种群对氯氟氰菊酯的表皮穿透率明显低于敏感种群,可能是其产生抗药性的一个原因。     

昆虫细胞色素P450的研究进展及其介导的抗药性

昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性、解毒代谢等方面具有重大研究价值.概述了昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性中所起的作用及其目前的一些研究进展,分析了其基因的结构和特点,从结构决定功能这个角度阐述了该酶的功能、表达及其诱导机制,从分子学角度分析了昆虫细胞色素P450介导昆虫抗药性的分子机制.     

二斑叶螨抗四螨嗪品系筛选及其解毒酶活力变化

【目的】筛选二斑叶螨对四螨嗪的抗性,并明确其解毒酶的变化。【方法】采用室内生物测定和生化分析方法,研究二斑叶螨对四螨嗪的抗性发展趋势及其解毒酶活力变化。【结果】室内用四螨嗪筛选二斑叶螨21代（Clo-R21品系）,抗性倍数（RR）为122.26;Clo-R21品系对哒螨•四螨嗪和浏阳霉素具有较高的交互抗性,RR分别为21.80和10.66;对阿维菌素、甲氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、三唑锡和苦皮藤生物碱具有低水平的交互抗性,RR分别为6.85、5.45、5.02、3.88、3.48、1.68;对苯丁锡、唑螨酯、噻螨酮具有负交互抗性,RR分别为0.72、0.65、0.55;增效剂磷酸三苯酯（TPP）、顺丁烯二酸二乙酯（DEM）、胡椒基丁醚（PBO）、增效磷（SV1）对抗Clo-R21品系的增效比值分别为1.39、1.70、6.78、1.64;Clo-R21品系体内羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）、碱性磷酸酯酶（ALP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和多功能氧化酶（MFO）分别是敏感品系的2.25、2.04、1.91、1.98和26.68倍。【结论】二斑叶螨对四螨嗪的抗性主要受MFO介导,而CarE、ACP、ALP和GSTs也参与四螨嗪抗性的形成。