高脂诱导非酒精性脂肪肝对CYP2A5表达的影响

为了研究高脂诱导脂肪肝对CYP2A5表达的影响,选取雄性C57BL/6J小鼠18只,随机分成对照组(control)、高脂组(NAFLD)和阳性对照组(PYR),每组6只,分别饲喂基础饲料和高脂饲料,阳性对照组饲喂基础饲料在处死前一天给予吡唑诱导,连续8周后小鼠断颈处死,取肝脏测定mRNA,CYP2A5的蛋白表达和酶活性。其结果阳性对照组CYP2A5的mRNA、蛋白表达和酶活性与对照组相比分别增加229%、80%、151%差异极显著(P0.01)。高脂诱导组与对照组相比CYP2A5的mRNA、蛋白表达和酶活性分别增加69%、34%、43%(P0.01)。表明高脂诱导非酒精性脂肪肝可增加CYP2A5的mRNA、蛋白表达水平和酶活力。     

公鸡鸡冠发育相关候选基因的表达分析

为了探索鸡冠发育的分子机制,利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对前期采用转录组测序技术筛选出的7个与鸡冠发育相关的候选基因(BMP2、TPPP3、HSD17B2、CYP2W1、CYP1A4、EDA2R、HAL)进行表达分析。选取200只5周龄青脚麻鸡A系公鸡,从中筛选出15只高鸡冠和15只矮鸡冠公鸡,采用qRT-PCR定量分析7个候选基因在两组个体鸡冠组织的相对表达量,同时检测了7个候选基因在心、肝等11个组织的表达谱。结果显示:CYP2W1和TPPP3在高冠组表达量极显著高于矮冠组(P0.01);CYP4A1和EDA2R在高冠组表达量高于矮冠组(P0.05);HAL在高冠组中表达量极显著低于矮冠组(P0.01);HSD17B2和BMP2在高冠组中表达量显著低于矮冠组(P0.05)。表明BMP2、TPPP3、CYP2W1、EDA2R四个基因在鸡冠中的表达属于较高水平表达,其余基因在鸡冠组织中属于中等水平表达。提示这7个候选基因可能在调控鸡冠发育中发挥重要作用。     

雌激素通过ER-α调控CYP2C8在鸡肝中的表达

本研究旨在探讨鸡CYP2C8基因的表达调控规律。采集30周龄卢氏绿壳蛋鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指肠、空肠、回肠14种组织以及从1日龄~30周龄不同发育时期的肝组织,用荧光实时定量PCR分析CYP2C8基因的时空表达规律;用雌激素及其受体拮抗剂对活体和体外培养的鸡胚肝原代细胞进行处理,用荧光实时定量PCR分析CYP2C8基因的表达调控机制。结果表明,鸡CYP2C8基因在各组织中表现出广泛表达的特性,但在脂类代谢旺盛的器官如肝、肾、小肠(十二指肠、空肠、回肠)等器官中表达较高,且在肝中的表达水平随着性成熟而显著升高(P0.01);雌激素处理可显著提高鸡肝组织和体外培养的鸡胚胎肝原代细胞中CYP2C8的表达水平(P0.05),但雌激素受体ER-α拮抗剂MPP可完全抑制雌激素的作用(P0.05)。综上表明,鸡CYP2C8基因在不同组织中广泛表达,而以肝中的表达水平最高,且肝中CYP2C8基因的表达是受雌激素并通过ER-α调控。     

CYP19A1调控内源性雌激素合成促进牦牛COCs细胞自噬和早期发育能力

旨在探索牦牛卵母细胞成熟过程中细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom, CYP19A1)对内源性雌激素(17β-estradiol, E₂)分泌、卵母细胞自噬和后续胚胎发育能力的影响。本研究在牦牛卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)体外成熟过程中,分别用等体积生理盐水、最佳浓度E₂(10^-7 mol·L^-1)、CYP19A1诱导剂黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、CYP19A1抑制剂双酚A(bisphenol A, BPA)处理,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)、Western blot和免疫荧光技术检测各组成熟COCs中CYP19A1表达水平,酶联免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测诱导和抑制CYP19A1处理组牦牛成熟COCs培养液中E₂水平;分析不同处理组C...     

CYP11A1在牦牛不同级别卵泡及卵母细胞成熟过程中的表达

目的:本研究旨在探索CYP11A1在牦牛卵泡发育过程及不同成熟阶段卵母细胞中的表达情况。方法:采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测CYP11A1在不同级别卵泡(0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm及大于8 mm)和不同阶段(未成熟、成熟12 h、成熟18 h及成熟24 h)体外成熟卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs)中的表达定位。结果:CYP11A1基因在不同级别的卵泡中均有表达,卵泡大小为3～5 mm时,表达量最高,随卵泡不断扩张呈低水平表达,卵泡大小大于8 mm时,基因的表达量降为最低;在未成熟的COCs中相对表达量最低,成熟12 h的COCs中表达水平达到最高值,之后又呈现先下降后升高的趋势。IF检测结果显示CYP11A1在卵丘、卵母细胞中均有表达。结论:CYP11A1参与牦牛卵泡的扩张和卵母细胞的成熟过程,该结果有助于进一步研究CYP11A1在牦牛雌性生殖中的作用机制。     

荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达

目的:应用SYBR G reen I染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达。方法:采用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR G reen I为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达的动态变化。结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%。进行了标准曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量。结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化。     

小鼠细胞因子实时定量PCR检测方法的建立及应用

采用荧光SYBR Green I建立小鼠细胞因子mRNA实时定量PCR的检测方法;并利用建立的实时定量PCR的检测方法时感染H5N1禽流感病毒的BALB/c小鼠不同时间采集的肺脏组织中几种重要致炎细胞因子及趋化因子mRNA表达水平进行了检测.对HSN1禽流感病毒感染的BALB/c小鼠肺脏细胞因子的检测具有高度的特异性,检测的灵敏度为10~1～10~2拷贝数.H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,小鼠肺脏中IL-1β、IL-6、TNFα、MIG、IP-10、RANTES、MIF和HMGB1细胞因子mRNA表达水平与时照组小鼠相比均有明显差异.建立的实时定量PCR能在基因转录水平敏感和特异地反应细胞因子的表达水平,该技术在基础和临床免疫研究中,具有良好的应用价值.     

牦牛卵泡发育及卵母细胞成熟过程中CYP19A1表达差异分析

旨在探索CYP19A1在牦牛卵泡发育过程及不同成熟阶段卵母细胞中的表达水平。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测CYP19A1在牦牛不同级别卵泡(≤3 mm、3～5 mm、5～8 mm及≥8 mm)和卵丘—卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs)体外成熟的不同阶段(成熟0 h、12 h、18 h及24 h)中的表达水平,免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测CYP19A1蛋白在COCs中的表达定位。结果显示:CYP19A1基因在不同级别的卵泡中均有表达,在卵泡发育早期表达量最高,随卵泡发育呈低水平表达;CYP19A1基因在COCs中的相对表达量显示,未成熟(0 h)COCs的表达量最低,成熟18 h的COCs表达水平达到最高值,之后呈下降趋势。通过免疫荧光技术发现COCs中CYP19A1蛋白的表达主要集中在卵丘细胞上。推测CYP19A1在卵巢颗粒细胞中的表达有助于卵泡发育和卵母细胞成熟雌二醇(Estradiol,E_2)的分泌,对卵泡和卵母细胞早期发育有积极的调控作用,为进一步探索CYP19A1在牦牛雌性生殖中的作用机制提供了理论支撑。     

应用qRT-PCR方法检测鼠痘病毒在小鼠不同组织中的差异分布

鼠痘(mouse pox)是由鼠痘病毒(Ectromelia virus,ECTV)感染实验小鼠引起的一种毁灭性、烈性传染病,为SPF小鼠必须排除的病原之一。本研究基于ECTV主要核蛋白P4b基因片段建立了实时定量PCR方法(real-time quantitative PCR,qRTPCR),用于检测C57BL/6小鼠感染ECTV后心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中的病毒载量,并用病理组织学观察验证了qRT-PCR方法的特异性和可靠性。结果表明,所建立的qRT-PCR方法能够准确检测小鼠感染后d5和d7不同组织的病毒载量,d5不同组织中病毒载量低于d7,与病理组织学检测结果一致。本研究建立的qRT-PCR检测方法且具有较高的灵敏性、特异性和可靠性,可用于ECTV感染细胞和组织器官中病毒载量、分布和消长动态的定性定量检测。     

猪睾丸中脂联素受体与LHR、CYP11A1、StAR基因表达的发育变化及其相关性研究

旨在了解皖南花猪睾丸组织脂联素受体mRNA与睾酮合成相关因子mRNA表达的发育性变化及其相关性,探讨脂联素与睾酮生成的关系.本研究用荧光实时定量PCR法检测0、30、45、90和180 d等不同日龄(各日龄样本数5头)皖南花猪睾丸组织脂联素受体(AdpR1、AdpR2)和LHR、CYP11A1、StAR mRNA的表达水平.结果,AdpR1、CYP11 A1和StAR mRNA的表达有极显著的发育性变化(P＜0.01),AdpR1 mRNA的表达先增加后降低,45 d达到最大值;CYP11A1和StAR mRNA的表达先升高后降低再升高,45 d达到最大表达量.LHR mRNA的表达也有显著的发育性变化(P＜0.05),整体表现为先升高后降低.AdpR1与CYP11A1 mRNA的表达量显著相关(r=0.587,P＜0.05);LHR与CYP11A1、StAR mRNA的表达量分别显著相关(r=0.528,P＜0.05;r=0.552,P＜0.05);CYP11 A1与StAR mRNA表达量极显著相关(r=0.709,P＜0.01).AdpR1mRNA在睾丸组织的高表达提示脂联素可能通过AdpR1介导对睾丸的调节作用,其发育性变化和CYP11A1 mRNA呈正相关,提示脂联素对睾酮的生成有一定的促进作用.