猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的核苷酸及氨基酸同源性较低.说明建立的针对N蛋白的多种检测方法在高致病性PRRSV肆虐的现今仍具有实用性.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

2015-2016年北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

为了解北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2015-2016年省内各地163家养殖场的874份PRRS疑似病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的ORF5基因进行测序及变异分析.结果显示,PRRSV阳性样品共209份,阳性率为23.9%.扩增阳性样品的ORF5基因序列,并选取44条有代表性的基因序列,遗传进化分析表明,北方某省PRRSV流行毒株为美洲型毒株,其ORF5基因核苷酸同源性为82.6%~99.5%,与VR-2332、CH-1a、HuN4和JXA1、CHsx1401和NADC30株的核苷酸同源性分别为83.5%~99.3%、85.1%~95.2%、83.5%~99.3%和82.4%~96.8%.基于ORF5基因核苷酸序列绘制的遗传进化树显示,目前北方某省流行的美洲型PRRSV可分为4个亚群,其中24株属于以CHsx1401和NADC30为代表的Ⅱ亚群,19株属于以HuN4和JXA1为代表的Ⅳ亚群,1株属于以VR2332为代表的Ⅰ亚群.各毒株ORF5基因序列之间存在一定差异,但无明显地域性.本研究结果可为北方某省PRRSV遗传进化研究和疫病防控提供参考.     

辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF5-7基因遗传变异分析

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332全基因序列,设计并合成2对引物,采用RT-PCR技术,对辽宁省站送检的病料进行分离扩增,分别获得相应的目的片段,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并送上海生工测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、BJ-4、LV-M96262及疫苗株的ORF567基因进行序列比较,通过核苷酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为89.5%～95%,与LV-M96262的同源性为54%～58.3%.氨基酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为82.8%～94.7%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

甘肃省猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析

为了解甘肃省地方猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的感染情况,对2015-2020年采集的20个猪场332份疑似PRRSV感染猪的样品,首先进行血清学检测,然后通过RT-PCR方法开展病原检测,扩增PRRSV的ORF5基因;测序后利用DNA Star软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系。血清学检测结果阳性率为93.07%,扩增获得的PRRSV ORF5基因,经核苷酸序列比对属于PRRSV美洲型,有NADC30-like毒株和NADC34 like毒株。结果表明,当前PRRSV不同流行毒株存在一定的遗传差异,为甘肃省PRRS防控提供了科学依据。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析.结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段.遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支.氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异.结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异.研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异和系统进化分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株间变异广泛,而且这种变异能够筛选出强毒株。在结构蛋白中GP5的变异率最高,其变异能够导致病毒毒力的变化。为了确定PRRSV在我国的进化趋势和毒力增强的原因,对从2003年以来分离到14株PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行分析并构建了系统进化树。结果显示2006年以来从国内分离的毒株其糖基化位点发生了明显改变,并且在系统进化树上形成了新的分支,进化分析显示它们可能来源于1995年的中国分离株CH-1 a。     

Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates

Swine herds in the US have experienced recent outbreaks of a severe form of porcine reproductive and respiratory syndrome (designated acute or atypical PRRS) characterized by abortion and high mortality in pregnant sows. Most of the affected herds had been vaccinated with modified live-vaccines (MLVs) against PRRS. To explore the possible mechanism of the emergence of acute PRRS, the open reading frame 5 (ORF5) gene encoding the major envelope protein (GP5) of acute PRRSV isolates was characterized. The complete ORF5 gene of eight acute PRRSV isolates from herds experiencing acute PRRS outbreaks in Iowa and North Carolina was amplified and sequenced. Sequence analyses revealed that these acute PRRSV isolates shared 88-95% nucleotide and 88-96% amino acid sequence identities to each other, 87-97% nucleotide and 84-96% amino acid sequence identities with other North American PRRSV isolates and the MLVs. Most of the amino acid substitutions locate in the putative signal sequence and two short hypervariable regions at the amino terminus. The ORF5 gene sequence of the acute PRRSV isolate 98-37120-2 from a non-vaccinated swine herd in Iowa is very closely related to that of the RespPRRS MLV, with 97% nucleotide and 96% amino acid sequence identities. Phylogenetic analysis revealed that all eight acute PRRSV isolates are clustered within the North American genotype. Several minor branches that are not associated with geographic origins were also identified within the North American genotype. One acute PRRSV isolate (98-37120-2) is clustered with the RespPRRS MLV and several Danish isolates that were confirmed to be derived from the RespPRRS MLV. The ORF5 gene sequences of other seven acute isolates are more related to those of several earlier PRRSV isolates and the PrimePac MLV than to that of the RespPRRS MLV. Our results showed that the acute PRRSV isolates analyzed in this study differed from each other in ORF5 genes, although they all clustered within the North American genotype. The data from this study do not fully support the hypothesis that the emergence of acute PRRS is due to reversion of MLVs to a pathogenic phenotype, as only one of the eight acute isolates was shown to be very closely related to the RespPRRS MLV.     

6株高致病性PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的基因变异情况,对四川省2014-2015年蓝耳病发病猪场分离到的6株PRRSV毒株ORF5基因进行了克隆测序及序列分析。同源性分析表明,6株PRRSV分离株ORF5基因核苷酸(氨基酸)与VR2332株的同源性为88.9%~89.4%(86.5%~88.7%),与CH-1a株同源性为93.7%~94.7%(90%~92%),与JXA1株同源性为97.2%~98.5%(95%~97%),与美国新出现的变异株NADC30同源性为85.9%~86.7%(85.5%~87.5%),与欧洲型代表株Lelystad virus同源性为62.7%~63.7%(56.5%~57.5%)。遗传进化树分析表明,6株PRRSV与JXA1、HuN4等高致病毒株亲缘关系近,并位于同一分支。氨基酸序列分析表明,6株PRRSV ORF5基因编码氨基酸在PRRSV毒力相关位点aa13、aa151和区分野毒与疫苗毒的位点aa137均与JXA1、HUN4等强毒株相同,表明6个分离株均为较强的野毒株。在中和表位(aa37~aa45)和非中和表位(aa27~aa30,aa180~aa197)等区域与国内外参考毒株VR2332、CH-1a、JXA1、HUN4、NADC30、HENAN-XINX、JL580等相比,也出现了不同程度的变异。抗原性分析结果表明,6株PRRSV ORF5基因编码产物的抗原表位主要位于aa30~aa39,aa50~aa60,aa128~aa132,aa136~aa141,aa146~aa155,aa161~aa183,aa191~aa200,与JXA1具有相似的抗原性特征,而与VR2332差异较大,主要表现在aa30~aa39相较于VR2332株抗原区域明显变窄。而在6个分离株中,SN9的抗原表位明显低于其他任何毒株。本研究结果表明,四川省PRRSV流行毒株仍然为JXA1变异株,但在当前高频度活疫苗免疫下,其基因的变异和抗原表位的改变在加剧,需加强对PRRSV基因变异的监控。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南分离株ORF3～7基因克隆与序列分析

参照GenBank中公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株ATCC VR2332的ORF3～7基因序列,利用Pri mer软件分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的特异性引物,利用RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株分别扩增得到了大小约964、675、718、566和501 bp的片段,并将扩增的片段插入PGEM-T-easy载体进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析表明,河南分离株Hn-1/06株属于美洲型,同时将Hn-1/06株ORF3～7基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCC VR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析。     

Genetic variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in China from 2002 to 2007 based on ORF5

The complete open reading frame 5 (ORF5) sequences of 34 field porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates from China in 2002–2007 were detected and compared with the different variable Chinese isolates S1, CH-1a, HB-1, HB-2 and JXA1. The results showed that all isolates were of type 2 PRRSV and could be assigned to two clusters. The isolates in cluster sg1 was high similar with the highly pathogenic PRRSV strain JXA1, while sg2 clustered with type 2 PRRSV isolate VR2332. It was interesting that the isolate SH02 which was isolated from Shanghai in 2002 has 98.8% identity with JXA1 emerged in 2006. And the ZJJ07 isolate was found to be a natural recombinant between a Chinese highly pathogenic SY0608 isolate and a VR-2332 derivative NH04 isolate. Analysis of the potential glycosylation sites indicated that they were frequently mutated and formed five putative N-linked glycosylation (NGS) sites patterns based on N30, 33–35, 44 and 51 in those isolates. It indicated that the highly variable PRRSV strain with different NGS patterns spread widely in China. The great genetic diversity could be taken into consideration for the control and prevention of this disease.     

我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株NSP2基因的遗传变异分析

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在我国华东地区的遗传变异情况和发展趋势,本研究对2004年～2009年分离鉴定的38株PRRSV流行株NSP2基因高变异区进行序列测定及分析.38株PRRSV分离株核苷酸同源性为71.6%～99.6%,推导的氨基酸同源性为63.7%～98.3%,共分为5种基因缺失类型.系统进化分析表明:38个分离株按基因序列可分为NSP2基因亚型Ⅰ和Ⅱ,其中,28株属于NSP2基因亚型Ⅰ,各病毒株均具有至少30个氨基酸的缺失,基因同源性为92.9%～99.2%;10株属于NSP2基因亚型Ⅱ,均具有1个或不具有氨基酸的缺失,基因同源性为76.5%～99.6%.流行株显示由基因亚型Ⅱ逐渐向基因亚型Ⅰ变异的趋势,并且NSP2核苷酸的缺失数量呈上升趋势.由此显示,我国PRRSV流行株NSP2基因变异较大,并不断出现新的变化,因此,加强PRRSV流行株基因变异的监测十分必要.     

猪圆环病毒2型福建分离株ORF2基因遗传变异分析

为了解福建部分地区感染猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型及遗传变异情况,采集了9份来自福建4个地区临床疑似PMWS仔猪肺、肾、淋巴结组织,病毒核酸提取后用PCV2ORF2特异引物进行PCR扩增、凝胶电泳,鉴定5份阳性样品,阳性率55.6%,回收、纯化阳性条带后送生物公司测序。Base by Base软件分析发现5份阳性样品ORF2的变异程度很小,主要是1~7个碱基点突变,有1处2个碱基连续突变,没有插入或缺失突变,同源性为98.91%~99.84%。进化树分析显示5份阳性样品都属于Group 1群(PCV2b型)中的1A/1B亚型,表明来自不同地区的样品之间变异较小。结合GenBank中已收录的所有福建18株PCV2ORF2序列进行分析,发现PCV2b基因型占95.6%,其中1A/1B亚型占72.7%,1C亚型占27.3%,结果表明PCV2b基因型中的1A/1B亚型在福建地区广泛流行并占主导地位。研究结果对本地区选择相匹配的疫苗进行有效防控具有重要意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。