青岛地区鸭源四环素类耐药大肠杆菌流行情况调查及耐药基因分析

【目的】通过对山东青岛地区鸭源样品进行四环素类耐药大肠杆菌的分离鉴定,了解其流行分布规律。对耐药菌株进行药敏检测及耐药基因鉴定,研究四环素类耐药大肠杆菌多重耐药率及耐药基因携带情况,为抗生素的合理应用提供理论依据。【方法】以肉鸭泄殖腔拭子及盲肠样本为试验材料,通过四环素选择培养基分离大肠杆菌。采用琼脂稀释法测定耐药菌株对12种抗菌药物的敏感性,通过PCR检测四环素类耐药大肠杆菌携带耐药基因情况,进一步通过接合试验评估tet(X)基因的可转移性,进而对部分tet(X)基因阳性菌株进行全基因组测序,同时探究tet(X)耐药基因的遗传环境特征。【结果】采集的63份样品经分离鉴定,获得48株四环素耐药大肠杆菌,分离率为76.19%。药敏试验结果显示,所有菌株对四环素和土霉素耐药,对多西环素和氟苯尼考耐药率分别为93.75%和89.59%,且对多黏菌素、替加环素及美罗培南耐药率分别为64.58%、16.67%和4.17%;所有菌株均存在多重耐药现象,其中以耐7种药物最多。耐药基因检测结果与耐药情况基本相对应,耐药率高的药物相应耐药基因呈现较高携带率;其中floR、tet(A)、qnrS、mcr-...     

一株四环素耐药大肠杆菌耐药基因检测

黑龙江省齐齐哈尔市周边牛场发生了犊牛腹泻情况,通过检测发现致病菌为致病性大肠杆菌。通过纸片法药敏试验发现这株大肠杆菌对四环素极为耐药,通过PCR探究其携带的耐药基因,发现其携带tetK耐药基因。表明该株大肠杆菌通过tetK基因编码四环素类抗生素药物外排泵,将四环素类药物排出体外,保护细菌核糖体,从而使细菌产生耐药性。     

98株鸭源致病性大肠杆菌氨基糖苷类耐药基因型与耐药表型的比较

旨在调查鸭致病性大肠杆菌氨基糖苷修饰酶耐药基因(AMEs基因)的携带情况,探讨耐药基因与氨基糖苷类抗生素耐药表型的相关性。对98株鸭致病性大肠杆菌采用了K-B法,选用氨基糖苷类抗生素链霉素、新霉素、庆大霉素、阿米卡星、大观霉素和卡那霉素进行药敏试验,用建立的检测氨基糖苷类AMEs主要基因的四重PCR方法对上述菌株进行分子检测,并随机选取耐药基因ant(3″)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa和aph(3′)-Ⅱa各3个阳性扩增进行克隆测序,对药敏试验结果和基因检测结果进行比较分析。结果表明,98株鸭致病性大肠杆菌有67株对上述氨基糖苷类药物中的一种或多种耐药,耐药率为68.4%(67/98);有49株扩增出AMEs基因,AMEs基因的检出率为50%(49/98),其中ant(3″)-Ⅰa的检出率为30.6%(30/98),aac(3)-Ⅱa为13.3%(13/98),aph(3′)-Ⅱa为3.1%(3/98),ant(3″)-Ⅰa+aac(3)-Ⅱa为2.0%(2/98)、aac(3)-Ⅱa+aph(3′)-Ⅱa为1.0%(1/98),未检出aac(6′)-Ⅰb基因;序列分析结果表明,扩增产物与GenBank中的相应序列有很高的同源性(99%);AMEs耐药基因与耐药表型的符合率为73.1%(49/67),符合率从高到低依次为大观霉素60%(3/5)、庆大霉素55%(11/20)、链霉素33.3%(22/66)、卡那霉素19%(4/21)、新霉素12.5%(1/8)、阿米卡星0%(0/3)。另外有4株细菌检测到相关耐药基因但耐药表型为敏感,而有22株耐药表型为耐药却未检测到相关耐药基因。鸭致病性大肠杆菌氨基糖苷类耐药基因以ant(3″)-Ⅰa和aac(3)-Ⅱa两种为主,耐药性与相关耐药基因的检出率基本呈正相关。     

53株禽致病性大肠杆菌的耐药表型及耐药基因的检测

为了解禽致病性大肠杆菌耐药表型及耐药基因的情况,选取江苏、安徽等地分离的53株禽致病性大肠杆菌,采用药敏纸片法对9种抗菌药物进行药敏试验,并对四环素类tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(W)、tet(M)、tet(O)、tet(K)、tet(L)耐药基因,喹诺酮类GryA、ParC耐药基因,磺胺类sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ耐药基因,β-内酰胺类SHV、CTX-M、ompCA耐药基因,氨基糖苷类aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA耐药基因进行PCR检测。结果显示:53株禽致病性大肠杆菌对磺胺异噁唑、环丙沙星、氨苄西林、多西环素的耐药率较高,分别为88.68%(47/53)、71.71%(38/53)、86.79%(46/53)、75.47%(40/53)。其中50株禽致病性大肠杆菌表现为多重耐药,耐4、5、6种药物的现象最为普遍,且不同地区菌株存在差异。tet(A)是四环素耐药基因中最为流行的一种耐药基因(52.83%,28/53),喹诺酮类耐药基因主要由gryA(94.33%,50/53)、parC(94.33%,50/53)基因编码,耐磺胺类药物sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因均有检出,分别为96.23%(52/53)、98.11%(48/53)、86.79%(46/53),耐β-内酰胺类药物中仅检出ompC A基因(30.19%,16/53),在检测的11种耐氨基糖苷类耐药基因中,最为流行为aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰ基因,分别为92.59%(49/53)、98.11%(52/53)、100%(53/53)。耐药基因与相关耐药菌株检出率基本呈正相关。试验结果表明:53株禽致病性大肠杆菌耐药性高,耐药谱广,耐药基因流行现象十分普遍。本试验结果能为禽致病性大肠杆菌的耐药现状与临床用药提供理论指导。     

鸽致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药基因的检测

江苏省某鸽场鸽群出现呼吸困难,死亡增多现象,剖检病死鸽,呈现气囊炎、腹膜炎和皮下广泛性出血等病变。无菌采集脾脏、肺脏等脏器进行病毒分离,但未分离到病毒。选取健康鸽和病鸽各10只,测定新城疫抗体,其抗体水平均较高。同时,无菌采集病料分离到2株细菌,经分离培养、染色镜检、生化特性鉴定,确定为大肠杆菌,玻板凝集试验表明C株为O163型,D株为O138型。对分离到的细菌做药敏试验,结果表明,C株对链霉素等8种药物产生了耐药性,对氟苯尼考等4种药物敏感;D株对庆大霉素等5种药物产生耐药性,对链霉素等7种药物敏感。分别设计引物对其耐药基因进行PCR检测。     

犊牛肺源致病性大肠杆菌分离鉴定、耐药性及耐药基因检测

本试验旨在确定新疆石河子地区某牛场因呼吸系统疾病导致犊牛死亡的细菌性病原,并对分离病原进行系统进化分类、耐药表型和耐药基因分析。采用细菌常规分离结合全自动生化分析系统对分离株进行分离鉴定,采用纸片法和PCR方法对分离株进行系统分群、药敏表型及耐药基因的分析。从患病犊牛肺脏、肝脏及淋巴结组织分离鉴定出6株致病性大肠杆菌,6株分离株均呈多重耐药现象,其中对青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考、替考拉宁、克林霉素、美罗培南、四环素和妥布霉素的耐药率高达100%。氨基糖苷类耐药基因aacC2、β-内酰胺类耐药基因bla_CTX-M和bla_TEM、四环素类耐药基因tetA、喹诺酮类耐药基因gyrA、磺胺类耐药基因sul2携带率分别为66.67%、83.3%、66.7%、100%、100%和100%。结果表明,新疆石河子某牛场发生呼吸道感染死亡犊牛细菌性病原是大肠杆菌,且表现较强的多重耐药现象,分离株携带更为丰富的耐药基因。     

禽致病性大肠杆菌ST95流行菌株耐药表型及耐药基因分析

为探究禽致病性大肠杆菌(APEC)ST95类群菌株的耐药表型和耐药基因分布情况,对37株ST95 APEC菌株进行血清型、耐药性测定以及耐药基因检测。结果显示:37株ST95 APEC的优势血清型为O2:K1和O1:K1,所有禽源ST95菌株均为多重耐药(MDR)特性,其至少对12种抗生素耐药,ST95菌株对头孢类抗生素的耐药比率很高,对β-内酰胺酶抑制剂耐药率也达到35%,对非头孢类抗生素如环丙沙星、庆大霉素等同样具有广泛耐药性。PCR检测发现30株APEC菌株含有β-内酰胺酶基因,在这些ST95菌株中检测出多种质粒编码的抗性基因,如链霉素/壮观霉素抗性基因strA和strB等。研究表明ST95 APEC菌株呈现明显的广谱耐药特性,质粒携带的耐药基因广泛分布于ST95菌株。     

鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药基因的检测

从山东省滕州市某种鸡场的19只死胚及出壳弱雏中分离出6株大肠杆菌,平均分离率为36.84%。生化鉴定表明,这些致病菌均符合大肠埃希氏菌的生化特性。本实验用平板稀释法对6株鸡源致病性大肠杆菌进行了药敏实验,结果6株菌对五大类抗生素(氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、硝基呋喃类)的10种药物的耐药性以卡那霉素最高,四环素次之,呋喃妥因最低。设计了4对引物,采用PCR技术,对6株鸡源大肠杆菌的耐药基因进行了检测并对所得耐药基因进行了扩增及序列测定。     

广东地区水禽源大肠杆菌对四环素的耐药性及耐药基因检测

采用琼脂二倍稀释法测定256株水禽大肠杆菌分离株对四环素类药物的敏感性,并通过PCR方法调查分离株携带耐药基因tet A、tet B、tet C和tet M的情况。药敏试验结果表明256株水禽大肠杆菌分离株对四环素和多西环素耐药率分别为92.2%和77.3%。在237株大肠杆菌四环素耐药株中,tet A、tet B、tet C和tet M的携带率分别为49.8%、57.8%、49.4%和40.1%,仅8.0%的耐药株没有检测到4种耐药基因。结果表明:tet A、tet B、tet C和tet M广泛存在于水禽源大肠杆菌中。tet A和tet B对水禽源大肠杆菌四环素耐药株的产生起重要作用,主动外排作用是大肠杆菌对四环素产生耐药性的主要机制。     

贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药性及耐药基因检测

为考察贵州省猪源大肠杆菌对四环素类抗菌药的耐药情况和耐药基因的流行情况,本试验采用微量肉汤稀释法测定783株分离于贵州省8个地区规模化养殖场的猪源大肠杆菌对6种四环素类药物的敏感性,并通过PCR方法检测其携带四环素耐药基因情况。结果显示,猪源大肠杆菌对土霉素、四环素、金霉素、多西环素、米诺环素和替加环素的耐药率分别为97.3%、97.6%、96.6%、89.3%、48.0%和34.2%;土霉素和四环素的耐药水平最高,其MIC₅₀分别为256 和128 μg/mL,而MIC₉₀均为512 μg/mL,四环素的耐药倍数高于土霉素;米诺环素和替加环素的耐药水平最低,其MIC₉₀分别为32和4 μg/mL,耐药倍数相同;耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD和tetM的检出率分别为92.60%、41.50%、58.75%、58.62%和70.10%;耐药菌株中主要以tetA基因为主,且大多数以携带复合基因的形式存在;大肠杆菌对土霉素、四环素、金霉素、多西环素和米诺环素的耐药性分别与耐药基因tetB和tetM呈极显著相关（P<0.01）,tetD基因分别与对米诺环素和替加环素的耐药性呈极显著相关（P<0.01）。贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药情况十分普遍,尤其是四环素和土霉素,金霉素和强力霉素有高度耐药的趋势;外排泵是四环素类药物主要的耐药机制;在兽医临床上越来越严重的耐药情况与耐药基因的广泛存在有很大关系。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%~99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

鸡源致病性大肠埃希菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测

为了解鸡源致病性大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性变化和钝化酶耐药基因的携带情况及耐药基因与耐药性的相关性,从陕西、河南、河北、山西、宁夏和甘肃6省(区)的部分规模化养鸡场的病、死鸡中分离鉴定320株致病性大肠埃希菌。采用K-B药敏纸片法检测分离菌对6种氨基糖苷类药物的敏感性,PCR方法检测6种氨基糖苷类钝化酶耐药基因,用DNA Star软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性大肠埃希菌分离株对庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、新霉素和阿米卡星的耐药率分别为53.4%、49.3%、37.5%、34.7%、22.8%和5.3%,对妥布霉素和卡那霉素耐药率呈上升趋势,而对庆大霉素的耐药率虽呈下降趋势,但仍维持在40%以上。3重以上耐药菌株占80%(256/320)。氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅰ和aac(6′)-Ⅰ的检出率分别为50.9%、25.9%和3.1%,未检测到aac(3)-Ⅳ、ant(3′′)-Ⅰ和aph(3′)-Ⅱ基因。研究表明,分离的鸡源致病性大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性普遍存在,以多重耐药为主,且对妥布霉素和卡那霉素的耐药性不断上升。耐药基因aac(3)-Ⅱ和aph(3′)-Ⅰ的检出率与其耐药性呈正相关。     

禽致病性大肠杆菌分离株中fimC和papC的检测研究

菌毛是细菌的一种重要的黏附因子,细菌借助于菌毛对宿主黏膜上皮细胞的黏附作用,得以定居,并进一步到达宿主其他部位.……     

Development and Application of Multiplex PCR Method for the Drug Resistance Genes Detection in Avian Pathogenic Escherichia coli

To detect the drug resistance genes, the multiplex PCR method for drug resistance genes of β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, amphenicols, and sulfonamides were developed. Based on the sequences of drug resistance genes from GenBank, 17 pairs of specific primers were designed. Then, 4 multiple PCR assays were established through the optimization of PCR reaction conditions and primers concentrations (cat+floR+tetB+tetC; dfrA12+sul2+sul1+bla_CTX-M+bal_TEM-1; aac3+aph3+aadA1+strB; tetA+cmlA+strA+sul3). The sensitivity and specificity of these assays were determined. The multiplex PCR assays were used to detect the drug resistance genes of 42 avian pathogenic Escherichia coli (APEC). The drug sensitivity of these APEC strains were also determined, which were compared to the distributions of drug resistance genes in these strains. The results showed that the 17 drug resistance genes were effectively and specifically amplified in these 4 optimized multiplex PCR assays. The detection limits of the 4 multiplex PCR were 10³, 10⁴, 10⁴ and 10⁵CFU of bacteria, respectively. The established multiplex PCR assays are specific and rapid for the detection of drug resistance genes in APEC strains, which showed 92.86% coincident with the drug resistance for these strains. The developed 4 multiplex PCR are simple and rapid assays for drug resistance genes detection, which can be used for the epidemiologic study for drug resistance genes.     

哈尔滨地区猪源大肠杆菌PMQR基因流行性检测

为了解哈尔滨地区猪源大肠杆菌中质粒介导的氟喹诺酮耐药(Plasmid mediated fluoroquinolone resistant,PMQR)基因的流行情况,本文通过对哈尔滨地区规模化养猪场进行采样处理,最终分离得到67株猪源大肠杆菌菌株,采用微量肉汤稀释法测定其对8种药物的最小抑菌浓度,针对PMQR基因设计特异性引物进行PCR扩增,结果显示,对8种兽医临床常用抗菌药物耐药率较高,多表现为多重耐药。oqx AB,qnr S,aac(6′)-Ib-cr,qnr B,qep A的检出率分别为70.15%,64.18%,22.39%,13.43%,11.94%,并没有检测到qnr A、qnr C、qnr D基因,这表明,PMQR基因在哈尔滨地区猪群中存在很高的检出率,这势必会加剧临床用药的难度,并且还为基因的水平传播提供可能。     

常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测

本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法,用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列,设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序,建立4组耐药基因（cat+floR+tetB+tetC;dfrA12+sul2+sul1+bla_CTX-M+bal_TEM-1;aac3+aph3+aadA1+strB;tetA+cmlA+strA+sul3）的多重PCR反应体系。然后,检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因,同时,检测其耐药性,比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示,建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段,测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明,4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为10³、10⁴、10⁴和10⁵CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致,其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因,可用于耐药基因的传播、流行调查。     

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的２０株鸡致病性大肠杆菌进行了药敏实验,筛选出１３株耐氧量沙星（ＯＦＬ）的菌株。经质粒提取,电泳和转化实验,获得一株 粒倡导 的耐煌多重耐药菌株。该菌株对参试的１１种抗生素全部耐药菌株其中ＯＦＬＭＩＣＭ〉５０μｇ／ｍｌ。该菌Ｒ质粒电泳可见６条带,转化大肠杆菌ＤＨ５α,在２０μｇ／ｍｌＯＦＬ的ＬＢ学板筛选得到的转化子,该转化子含有原菌株中２．７ｋｂ的质粒,获得原菌株部分耐药性。连续转化５次,均     

鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

2006年10月—2008年5月,从国内5个省的9个规模型鸭场的发病鸭或死亡鸭分离、鉴定大肠杆菌67株,采用肉汤稀释法测定其对头孢3代、4代,碳青霉烯类、单环β-内酰胺环类和氟喹诺酮类药物的敏感性。结果表明,试验菌株对以上药物的耐药率分别为头孢曲松钠（56.7%）、头孢噻呋（71.6%）、头孢吡肟（31.3%）、头孢噻肟（49.3%）、左氧氟沙星（50.7%）、环丙沙星（71.6%）、加替沙星（62.7%）、亚胺培南（0%）、氨曲南（56.7%）,鸭致病性大肠杆菌的耐药性比较严重,且同类药物的交叉耐药不容忽视。     

鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性检测及耐药基因分析

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3),并利用多位点序列分型(MLST)分析耐药菌株间的亲缘关系。结果显示,33株鸭源多杀性巴氏杆菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐受,耐药率为37.1%(33/89);在耐药菌株中,sul1、sul2和sul3基因检出率分别为100%(33/33)、97.0%(32/33)和21.2%(7/33),其中sul1和sul2基因同时检出率为97.0%(32/33),sul1、sul2和sul3基因同时检出率为21.2%(7/33);所有耐药菌株均属于ST129型。以上结果表明,鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物具有一定的耐药性,其中的耐药菌株都属于同一序列型ST129,均携带有sul1耐药基因,且绝大多数耐药菌株同时携带sul1与sul2两种耐药基因,提示在福建、广东和江西等地需慎用磺胺类药物来防治该细菌的感染。