鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

将克隆的鸡γ-干扰素(Ch IFNγ)基因亚克隆至酵母表达载体p PICZα-A中,构建重组质粒p PIC-Ch IFNγ。将鉴定正确的质粒p PIC-Ch IFNγ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明Ch IFNγ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子量约为20 ku。表达产物粗提后以细胞病变抑制法检测其活性,效价为107.69U/m L;在鸡胚中能有效抑制H9N2亚型禽流感病毒的增殖;动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白具有较好的抗病毒活性。     

重组鸡γ-干扰素联合鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫效果的研究

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ, ChIFN-γ)对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)的免疫增强效果,取重组鸡γ-干扰素作为免疫增强剂,联合鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫SPF鸡,在免疫后24h和48h采集全血进行细胞因子检测,结果显示免疫后联合免疫组的IFN-γ和IL-4细胞因子水平要高于单独免疫疫苗组;免疫后7、14、21、28和35d分别采集血清测定抗体效价,通过检测血清中针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的HI抗体水平可知,联合免疫组产生的针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的抗体均高于单独免疫疫苗组。试验结果表明,重组鸡γ-干扰素对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)具有免疫增强作用。     

表达鸡γ-干扰素重组鸡传染性支气管炎病毒的构建及鉴定

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究以IBV疫苗株H120为病毒载体,在其非结构蛋白5a编码区上游插入鸡γ-干扰素(Ch IFN-γ)基因,通过反向遗传操作技术构建重组病毒。经RT-PCR和测序鉴定表明拯救获得重组病毒(r H120-c IFNγ/5a)。生物学特性研究结果表明,r H120-c IFNγ/5a感染鸡胚后能够引起特征性病变,但与其亲本病毒株H120相比,病毒的毒价及其在鸡胚中的复制能力有所下降。将r H120-c IFNγ/5a在鸡胚中连续传代,采用RT-PCR进行检测,结果表明Ch IFN-γ基因在病毒传至第9代时仍保持稳定,至第12代Ch IFN-γ基因出现部分或完全丢失现象。本研究结果为进一步研制以IBV为载体的新型基因重组疫苗奠定了基础。     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组HVT活疫苗免疫效力评价

为在SPF鸡和商品蛋鸡上评价一株表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素基因的重组HVT(r HVT-H9)活疫苗的免疫保护效力,试验将1日龄SPF鸡分为r HVT-H9疫苗组、灭活疫苗组和空白对照组,共3组(n=60,每组20只);1日龄商品蛋鸡除上述三组外另增加r HVT-H9疫苗与禽流感灭活疫苗(H9亚型,F株)联合免疫组,共4组(n=80,每组20只)。免疫后,通过血凝抑制试验检测血清中针对H9亚型AIV的抗体效价;并于免疫后28 d,将全部试验组及空白对照组以H9亚型AIV F株进行静脉注射攻毒。攻毒后第3、5天分别采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况;并于攻毒后第10天将全部试验鸡进行剖检。结果显示:SPF鸡r HVT-H9疫苗组能达到100%免疫保护,而灭活疫苗组仅能达到80%保护;商品蛋鸡r HVT-H9疫苗组保护率为40%,灭活疫苗组保护率为70%,但联合免疫组能达到100%的免疫保护。因此,该重组病毒r HVT-H9疫苗可作为H9亚型禽流感的有效疫苗候选株,与现有商品化禽流感H9亚型灭活疫苗联合使用,效果更佳,为其防控提供一定的技术支持。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对H9亚型禽流感流行毒株的保护效果

为了检验鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对H9亚型禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,将鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗免疫接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AI(H9)HI抗体,并用2004年-2012年分离的8株H9亚型禽流感病毒对免疫接种鸡进行攻毒试验.结果显示,试验鸡免疫接种三联灭活苗后21 d,其H9 HI抗体效价可达11.88 log2,可抵抗8个不同H9亚型禽流感流行毒株的攻击,总攻毒保护率达92.50％(37/40).鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗中H9亚型禽流感毒株具有良好的免疫原性,能抵抗不同年代不同地区分离的H9亚型禽流感流行毒株的攻击.     

一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对禽流感H9亚型流行株攻毒的保护作用

为了监测鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(LaSota株+M41株+SS/94株)对H9亚型禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,采用H9亚型禽流感病毒SS/94株及2009—2010年现地分离的3株H9亚型禽流感病毒对已免疫上述三联灭活苗的SPF鸡进行攻毒试验。结果显示,试验鸡以0.3 mL/只的剂量免疫三联灭活苗后21 d,其H9亚型禽流感病毒的HI抗体效价可达8～11log2,此抗体水平可抵抗2×106EID50的H9亚型禽流感病毒SS/94株、BLCN09株、WDZ09株、YT10株的攻击,攻毒保护率均达90%(9/10)以上。可见,以SS/94株作为禽流感疫苗抗原制备的三联灭活苗具有良好的免疫原性,能使免疫鸡抵抗2009—2010年期间现地分离的多株H9亚型禽流感病毒的攻击。     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。