IFN-γ体外释放法检测牛结核病

牛结核病（bovine tuberculosis,bTB）是由牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病,其中奶牛为最易感动物。伴随我国奶业的快速发展,奶牛结核病近年来蔓延全国,不仅阻碍着我国奶业的可持续发展,而且严重威胁食品安全和公共卫生。近年发展起来的IFN-γ体外释放法为结核病的诊断提供了新的方向。本研究利用融合蛋白RCE刺激的IFN-γ体外释放法试验对某奶牛场59头奶牛进行检测,确定被检奶牛是否感染结核分枝杆菌。共检出阳性牛44头,阴性牛15头。与结核菌素皮内变态反应相比较,其敏感性为75.6%,特异性为26.1%。本试验为牛结核病IFN-γ诊断试剂盒的研究提供了数据支撑。     

牛结核γ干扰素ELISA检测方法的建立及应用

为建立快速、敏感的牛结核分枝杆菌检测方法,本研究利用两株牛γ干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(MAb)建立检测牛IFN-γ的抗原捕获夹心ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗体包被浓度为5μg/mL;全血刺激上清最佳稀释倍数为1∶2,作用时间为1 h;最佳酶标抗体作用时间为1 h;底物作用时间为15 min。该方法对重组牛IFN-γ的最小检测量可达25 pg/mL,对重组和天然牛的IFN-γ均具有特异性,与IFN-α、IFN-β或白细胞介素4为阴性反应;与山羊和绵羊的IFN-γ呈阳性反应,而与猪、鸡、鹿、犬和人的IFN-γ呈阴性反应。通过对177头牛进行检测,该方法与皮内变态反应的符合率为78.9%,与进口试剂盒的符合率为89.8%,表明该方法具有良好的应用价值。本研究为牛结核早期及其潜伏期感染的监测及流行病学调查提供了快速敏感的检测方法。     

双抗体夹心ELISA检测水牛γ-干扰素方法的建立及初步应用

纯化2株针对水牛γ-干扰素的单克隆抗体,其中1株进行HRP标记作为检测抗体,另1株单抗作为捕获抗体,建立检测水牛γ-干扰素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)。通过对封闭液、抗体稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为625 ng/mL,检测抗体的工作效价为1∶100;所建立的DAS-ELISA方法检测灵敏度25 ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%。采集60头单次皮内注射结核菌素的水牛肝素钠抗凝全血,利用牛结核杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT-6融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较,结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为62%,特异性为87%,符合率为75%,表明可应用于水牛结核病的检测。     

牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用

以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素（Pokeweed mitogen,PWM）刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清（13.8μg/mL）配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL（30.5 pg/100μL）的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。     

禽类IFN-γmRNA表达量检测方法的初步建立

为了建立检测IFN-γmRNA表达量的方法，设计2对用于IFN-γ和1对用于β-actin基因扩增的引物，建立可用于IFN-γmRNA表达量检测的技术。结果表明：用RT-PCR技术检测5组免疫鸡和1组对照鸡外周血单个核细胞发现，全病毒和含有全病毒的疫苗比单一肽段进行免疫IFN-γmRNA表达量要大的多，但与对照组没有明显差异。     

基于结核菌素与CFP10／ESAT6的牛IFN-γ检测法在牛结核病诊断中的比较研究

本研究通过比较三种刺激物（牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10／ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液．肝素抗凝。每1mL全血与1mL RPMI1640完全培养基混合均匀,并加入0.1mL（20μg）PHA（阳性对照孔）、0．1mL（20μg PHA）CFP10／ESAT6融合蛋白、0．1mL（2000U）＆结核菌素（PPD／B）、0．1mL（2500u）禽结核菌素（PPD／A）或等量PBS（无刺激阴性对照）,37℃培养过夜。次日用夹心ELISA法检测各刺激组0．1mL培养上清的IFN-γ,以OD630表示IFN-γ浓度。结果,特异性抗原CFP10／ESAT6刺激组与牛结核菌素（PPD／B）刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性．相关系数为0．84。但CFP10／ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应（以两刺激组IFN-γ浓度差值表示）间无相关性,相关系数为-0．11。分析禽PPD组的IFN-γ反应,发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0．17为阳性反应切割值,牛PPD检出阳性牛21头,CFP10／ESAT6检出20头,牛和禽PPD比较反应（以OD值差值表示）检出14头,禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后,牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0．54。结果表明,牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核菌与环境分枝杆菌混合感染时．应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低,混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10／ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性与敏感性。     

猪IFN-γ竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪IFN-γ的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增380bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-TEasy载体中,构建成含IFN-γ部分基因片段的重组质粒。利用反向PCR技术构建和扩增380 bp片段共用同一对引物但缺失163 bp的竞争重组子。通过重组质粒与竞争重组子,建立猪IFN-γ的标准竞争曲线和直线回归方程,为进一步检测IFN-γ的mRNA的转录水平变化奠定基础。     

猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞（PBMC）,经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA.以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因.把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒.用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp（含PstⅠ酶切位点）的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒.将pMD-IFN257双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板.以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程（y=0.414x-1.864）.     

γ-干扰素释放法检测奶牛结核病的比较试验

目的：评价γ-干扰素释放试验（IGRA）牛结核病检疫过程中的效果。方法在牛结核病检疫过程中对皮试初筛为结核病和疑似结核病的89（74/15）头奶牛同时进行r干扰素试验、单纯颈部皮试变态反应（SCT）和比较皮试变态反应（CCT）检测,结果单纯颈部皮试变态反应二次检疫中89头牛均判为阳性,单纯颈部皮试变态反应与比较皮试变态反应的阳性符合数为67头。阳性符合率为75.3％;γ-干扰素释放试验和单纯颈部皮试变态反应检测两者的阳性符合数为64头,阳性符合率为71.9％;γ-干扰素释放试验与比较皮试变态反应的阳性符合数为58头,阳性符合率为79.5％。阴性符合数为16头,阴性符合率为48.4％;结论γ-干扰素释放试验在保持较高灵敏度的同时,具有比变态反应更好的特异性。     

牛结核γ-干扰素ELISA检测方法在检疫工作中的应用

为评价牛γ-干扰素ELISA检测方法检测牛结核的效果及国产试剂盒的检测效果,本试验首先将国产试剂盒与Prionics试剂盒对42份相对阳性的样品和105份相对阴性的样品进行对比研究。然后对5个规模化牛场的3000头奶牛首先进行国产单纯结核菌素颈部皮内变态反应试验,3天后选取皮内变态反应阳性和可疑及部分阴性牛共418头,进行牛γ-干扰素试验。结果国产试剂盒对阳性和阴性样品的检测敏感性和特异性分别为95.2%和100%,与Priobics试剂盒的符合率为99.3%。表明国产试剂盒与进口试剂盒的检测能力一致,牛γ-干扰素检测方法准确可靠。5个牛场的3000头奶牛单纯结核菌素颈部皮内变态反应试验阳性为138头,可疑105头。γ-干扰素试验对418头奶牛的检测,其中阳性74头,与颈部皮内变态反应（可疑牛暂时视为阴性）的符合率为60.5%。     

牛γ干扰素单克隆抗体的制备与抗原捕获ELISA检测方法的建立

为了建立一种简便、快速、可靠和经济的牛γ干扰素(BOIFN-γ)的免疫学检测方法,本研究通过杂交瘤技术建立了2株抗rBoIFN-γ单克隆抗体(MAb)2G6和5F9.Western blot、抗病毒活性阻断实验表明2株MAb与rBoIFN-γ有高亲和活性.相加EUSA表明2G6和5F9识别rBoIFN-γ不同的抗原表位.利用2G6作为捕获抗体,5F9-HEP作为检测抗体建立的抗原捕获ELlSA方法可特异性的检测不同系统表达的rBoIFN-γ,而且与rBoIFN-a、rBoIFN-β不发生交叉反应.该方法的建立为抗原捕获ELISA定量检测BoIFN-γ试剂盒的研制奠定了基础.     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

2015年四川省4个县牛结核菌素γ-干扰素ELISA检测报告

笔者对我省4个县的498头牛进行结核菌素γ-干扰素ELISA检测,结果显示,平均阳性率为3.21%,4个县阳性率分布不均,阳性率最高4.38%,最低为0.牛结核菌素γ-干扰素ELISA法具有省时、省力、客观、准确等优点,但价格较昂贵,操作相对复杂,基层大面积推广有一定难度,适用于结核菌素皮内变态反应阳性动物的复核和感染早期诊断.     

直接ELISA检测沙门氏菌方法的建立及其应用研究

从已获得的４株沙门氏菌属特异杂交瘤单克隆抗体中，筛选出ＣＢ８和Ｄｅ７两株单抗相合成酶标检测试剂，并建立了检测沙门氏菌的直接ＥＬＩＳＡ方法，它能检出沙门氏菌属９９％的菌株，而不与其他肠道杆菌反应（包括大肠杆菌，阴沟杆菌，产气杆菌，志贺氏菌，枸椽酸杆菌，克雷伯氏菌，变形杆菌和沙雷氏菌）。应用本方法检测粪样，鱼粉，奶样，其敏感性和特异性分别高达１００％和９７．６％，仅出现２．４％的假阳性率，该法不受各要     

应用竞争PCR定量检测猪IFN-γmRNA

运用RT-PCR从经ConA体外刺激培养的猪外周血单核细胞(PBMC)提取的细胞总RNA中扩增猪γ-干扰素(IFN-γ)的部分片段,经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段,将余下的2个较大片段连接,并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物,从而获得截短的同源性片段.将其纯化后克隆于pMD18-T载体,重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行序列测定,验证无误后作为竞争性模板内对照,一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的PBMC总RNA反转录产物进行PCR,产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭(EB)嵌入光密度值(IOD),经校正后取上述两者比值的对数值作为Y轴,取已知竞争模板相应浓度的对数值作为X轴,绘制成竞争曲线.应用建立的竞争PCR对不同样品重复试验表明,本方法操作简单,结果可靠,稳定性高,适用于猪IFN-γ mRNA的定量检测.     

IFN-γ研究进展及其在猪繁殖与呼吸综合征研究中的应用

γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)是干扰素的一种,又称为Ⅱ型干扰素或免疫干扰素,主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ是动物机体最重要的细胞因子之一,是主要的巨噬细胞活化因子(macrophage activating factor,MAF),具有强大的免疫调节作用和抗病毒、抗肿瘤作用。目前,干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛关注,已被应用于人类疾病临床治疗和动物疾病防控研究。作者就IFN-γ的基本特征、生物学活性、检测及其在猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)中的研究应用进行了综述。     

PRRSV体外感染PAMs对IFN-γ mRNA转录水平的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对IFN-γmRNA转录水平的影响,选用PRRSV血清抗体和抗原均为阴性的4周龄健康仔猪3头,无菌分离PAMs,随机将其分为对照组、PRRSV感染组(PRRSV组)、PRRSV+PHA组和RRRSV+Dex组,分别在培养6、12、24、48和60 h收集PAMs。运用荧光定量PCR检测IFN-γ和PRRSV mRNA转录情况。结果显示,PRRSV mRNA转录量在感染PAMs后6~24 h逐渐升高,在48 h有所下调,在60 h再次升高,IFN-γmRNA转录量在6~48 h逐渐升高,24、48 h显著高于对照组,而到60 h又恢复到对照组水平;与同时间点的PRRSV组相比,PRRSV+PHA组中PRRSV mRNA转录量有所下调,IFN-γmRNA转录量有所上调;而RRRSV+Dex组PRRSV mRNA转录量有所上调,IFN-γmRNA转录量所下调。结果表明,IFN-γ在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖,IFN-γ的抑制可能是PRRSV导致细胞损伤的机制之一。     

国家二类新兽药牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒

牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒的原理是基于细胞免疫建立的牛结核病检测方法。结核病阴性牛淋巴细胞经牛型提纯结核菌素(PPDB)刺激后不产生IFN-γ,结核病阳性牛淋巴细胞经PPDB刺激后,产生大量IFN-γ。通过建立经PPDB刺激后的待检牛全血中IFN-γ的ELISA方法,从而实现对牛结核病的准确、快速和高通量检测。     

庆大霉素ELISA检测方法的建立与应用

本实验利用戊二醛法合成抗原,进行动物免疫,制备特异性强的单克隆抗体。建立了庆大霉素ELISA检测方法,方法灵敏度为0.1μg/L,半数抑制浓度IC50为0.295μg/kg,将建立的庆大霉素ELISA检测方法应用于肌肉组织的检测中,得到最低检测限为7.91μg/kg,样本添加回收率在70%～120%之间,变异系数小于15%,该方法的建立为庆大霉素的残留检测提供了可靠的分析检测手段。     

PRRSV特异性肽对CSF、PRRS免疫猪IFN-γ、IL-10分泌的影响

应用PRRSV-GP5特异性肽刺激CSF、PRRS免疫猪外周血淋巴细胞,采用ELISA方法测定不同时间点淋巴细胞分泌IFN-γ及IL-10的水平,分析PRRSV-GP5特异性肽刺激后,淋巴细胞培养上清中细胞因子的变化规律。结果显示,CSFV高抗PRRSV低抗体组于PRRSV免疫14d,肽刺激组中IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05);其他组均差异不显著(P>0.05)。PRRSV免疫14d,细胞培养24,72h后加PRRSV-GP5肽刺激,各组中试验组与对照组相比IL-10水平明显降低(P<0.01);PRRSV免疫28d,各组中肽刺激组与空白组相比,IL-10水平均无显著性差异(P>0.05)。结果表明,PRRSV-GP5肽在PRRSV免疫早期可以促进IFN-γ的分泌,并抑制IL-10的产生,但在免疫后期对淋巴细胞分泌的调节作用还需进一步研究。