兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞.以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆.测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等.本研究鉴定的与RHDV VP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础.     

兔出血症病毒结构蛋白及其降解产物的分析

采用弗里昂１１３抽提结合庶糖梯度密度离心法从人工感染兔出血症病兔肚脏组织中纯化ＲＨＤ病毒，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ＲＨＤＶ由一种结构蛋白构成，分子量为６０ＫＤ，称为ＶＰ６０。应用抗ＲＨＤＶ单克隆抗体进行免疫印迹试验表明，ＶＰ６０可发生蛋白降解，其产物有３８ＫＤ、２８ＫＤ和２６ＫＤ几种多肽成分。     

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

兔出血症病毒分子生物学研究进展

兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种急性、高度致死性传染病，病死率可高达100％，给养兔业带来了巨大的经济损失。近年来，随着对其研究的不断深入，在病毒分子生物学方面取得了很大的进展。文章主要从基因组结构及功能、编码的结构蛋白与非结构蛋白、基因疫苗等方面系统阐述了兔出血症病毒分子生物学方面的研究进展，同时，提出了存在的问题和展望。为进一步研制兔出血症病毒基因工程疫苗及诊断试剂提供理论基础，以期能更有效地防治此病。     

兔出血症病兔肝脏酶组织化学变化的研究

用组织化学染色法对感染兔出血症(RHD)不同病期(潜伏期、高热期、濒死期和死亡期)病兔的肝脏碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸酸脱氢酶(LDH)的活性变化进行了动态观察.结果表明:肝脏AKP、ACP和LDH活性在潜伏期至高热期增强,以后各期均减弱;ATPase和SDH在病程各期均明显减弱,从而推论,肝细胞的坏死与ACP活性增强、溶酶体活跃有关,黄疸的发生与ATPase活性减弱及肝细胞线粒体受损有关;病兔的肝脏代谢以无氧酵解为主.     

兔出血症病兔肝脏酶组织化学变化的研究

用组织化学染色法对感染兔出症不同病期病兔的肝脏碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶和乳酸酸脱氢酶的活性变化进行了观察。结果表明：肝脏ＡＫＰ、ＡＣＰ和ＬＤＨ活性在潜伏期至高热期增强，以后各期均减弱；ＡＴＰａｓｅ和ＳＤＨ在病程各期均明显减弱，从而推论，肝细胞的坏死与ＡＣＰ活性增强、溶酶体活跃有关，黄疸的发生与ＡＴＰａｓｅ活性减弱及肝细胞线粒体受损有关，病兔的肝脏代谢以无氧酵解为主。     

兔出血症病毒（RHDV）研究进展

兔病毒性出血症 (RHD)是由兔出血症病毒（ RHDV）引起的一种高度接触传染性、急性、致死性传染病，以传染性极强、呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征，其发病率和致死率都很高，是兔的一种毁灭性传染病。目前所有已测的兔的品种（系）都表现出对该病的易感性，但在自然条件下， RHDV只感染年龄较大的家兔， 2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病自 1984年春在我国江苏无锡、江阴等县市首先暴发后，迅速流行蔓延开来，迄今为止，包括台湾地区在内的所有省份都有 RHD的流行报道。此后朝鲜于 1986年开始…     

Egg yolk IgY against RHDV capsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection

VP60 capsid protein is the major structural and immunogenicity protein of RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV), and has been implicated as a main protein antigen in RHDV diagnosis and vaccine design. In this report, egg yolk antibody (IgY) against N-terminal of VP60 was evaluated and developed as a new strategy for RHDV therapy. Briefly, N-terminal of VP60 (～250aa) fragment was cloned and inserted into pET28a expression vector, and then the resultant plasmid, pET28a/VP60-N, was transformed into E. coli BL21(DE3) for recombinant VP60-N protein (rVP60-N) expression. Next, the rVP60-N was purified by Ni⁺-affinity purification chromatography and identified by Western blotting with RHDV antiserum. After immunizing the chickens with rVP60-N, the anti-rVP60-N IgY was isolated, and the activity and specificity of the IgY antibody were analyzed by ELISA and Western blotting. In our results, the rVP60-N could be expressed in E. coli as soluble fraction, and the isolated anti-rVP60-N IgY demonstrated a high specificity and titer (1:22,000) against rVP60-N antigen. For further evaluation of the IgY efficacy in vivo, rabbits were grouped randomly and challenged with RHDV, and the results showed that anti-rVP60-N IgY could significantly protect rabbits from virus infection and promote the host survival after a sustained treatment with anti-rVP60-N IgY for 5 days. Taken together, our study demonstrates evidence that production of IgY against VP60 could be as a novel strategy for the RHDV therapy.     

兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析

根据GenBank已发表的多株RHDV全基因组序列，设计3对扩增RHDVCD株的特异性引物，扩增了RHDV CD株包含全序列的3个片段，并分别克隆到pMD18-T载体上。根据引物上唯一的交叉酶切位点，把三个克隆片段同时克隆到pUC18载体上，获得了RHDV CD株全基因组克隆，测定了全基因组序列（GenBank accession number AY523410）。进行了CD株全序列与GenBank上已发布的其他6株全序列比较及基因进化树分析。发现除CD株外，其余6株（西班牙AST-89株、法国SD株、意大利BS89株、德国分离1株、德国分离2株、澳大利亚Czech V351株）之间的同源性均很高，在93．9％～100％之间，而CD株与其他6株之间的同源性均较低，在89．0％～89．6％之间。德国的2个分离株序列完全相同，应为同一毒株：进化树分析表明，此7株病毒可形成2个明显的分支，中国CD株形成一个分支，其余欧洲、澳大利亚分离株开成一个分支，具有明显地域差异特征．     

RHDV在多种属动物体内分布及细胞免疫水平

应用纯化兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV),接种小鼠、豚鼠、SPF鸡、仔猪4d后剖杀,分离组织,通过电镜观察、血凝试验(HA)、RT-PCR,进行体内分布检测;同时将上述动物进行3次免疫,三免后10d分离外周血淋巴细胞进行IFN-γ、IL-4、WST检测病毒刺激指数(SI)。结果显示,通过电镜观察未见到病毒粒子;HA检测结果为肝脏的HA价最高,而肺脏最低;RT-PCR未检测到目的基因;WST检测结果免疫组刺激指数高于对照组;免疫组的IFN-γ和IL-4检测数高对照组。结果表明,RHDV在多种属动物分布规律相同,均能产生细胞免疫反应,为下一步试验奠定基础。     

一株兔病毒性出血症病毒的分离鉴定

从山东东营某兔场送检的疑似兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD)病料中分离到1株病毒(DY株)。通过血凝性及RT-PCR鉴定,以及毒力和免疫原性测定。结果显示:分离株DY株为兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV),对人O型红细胞具有高度凝集性,血凝效价为12log2,RHDV抗血清可特异性抑制这种凝集作用;RT-PCR扩增出RHDV VP60的201 bp基因片段;RHDV DY株对家兔的LD50为10-6.5/m L,是一株对家兔具有高致病力的强毒株。取第5代RHDV DY株制备灭活疫苗免疫试验兔,免疫后第14d攻毒,对RHDV的保护率达100%。     

兔病毒性出血症快速检测方法的建立

兔病毒性出血症是兔的1种传播性极强、致死率极高的重要传染病,针对性地加强该病原的进出境监测将对动物疫病防控具有重要的意义。本研究使用软件分析设计RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR的引物和TaqMan探针,建立了兔病毒性出血症RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法,并测定其特异性和敏感性。试验结果显示,只有阳性参照样品的DNA出现扩增,其他对照样品均未见扩增产物,证实这些检测方法具有良好的特异性。对阳性样品DNA进行10倍梯度稀释,再分别用新建的2种方法进行试验,结果显示兔病毒性出血症RT-PCR检测的DNA下限量为100 pg,实时荧光定量RT-PCR的DNA下限量为100 fg,2种方法都具有较高的敏感性。新建的RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法互补应用,有助于缩短检疫周期、提高检测效率,为出入境口岸部门加强入境试验兔或其他不同用途兔的疫病检测提供技术保障。     

兔病毒性出血症疫苗毒株的保存及免疫效力研究

采用1985年本实验室分离鉴定的一株RHDV（武汉分离株），制备RHDV灭活疫苗和RHDV-抗血清治疗剂，推广应用12年均获得较好的防治效果。长期保存，反复活化的RHDV肝组织血凝效价在1：640-1：2560;疫苗保护率约99％;RHDV-抗血清治愈率80％。结果显示该株RHDV的免疫原性稳定，同时亦表明近12年在武汉周边地区RHDV的抗原性变异不大。此研究可为RHDV流行病学研究和防治提供具有应用价值的试验依据。     

响应面法优化柑桔皮渣发酵蛋白饲料辅料及其配比研究

以柑桔皮渣为发酵原料,利用黑曲霉(A)、米曲霉(B)、扣囊腹膜胞酵母(C)三种菌种进行固态发酵,根据Plackett-Burman和Box-Benhnken实验设计,运用SAS和MATLAB软件,以发酵产品中可溶性蛋白和粗蛋白含量为考察指标,考察麸皮、玉米芯、玉米皮、秸秆、豆饼粕、废水、尿素、Na2HPO4、K2SO4、NaCl等十种辅料对发酵产品中蛋白含量的影响,确定最优辅料及其配比。结果表明,在发酵时间为3d、发酵温度为29℃条件下,当柑桔皮渣:麸皮:秸秆:尿素的质量比为20:3.25:4.97:0.04时,发酵产品中可溶性蛋白含量达到最大,为3.119mg/g。     

兔病毒性出血症病毒保藏及其对疫苗效果的研究

将不同地区收集到的8株兔病毒性出血症典型病料，放在－30℃低温冰箱中分别保藏5年和10年，保藏期满后取样检测血凝效价，并用保藏5年的RHDV病料和2001年活化增殖的新鲜病料分别制成病毒疫苗。试验结果表明RHDV以病料形式（主要是肝、肺等脏器）保藏，在－30℃低温冰箱中，经5年后，病毒血凝效价稳定不变，保藏10年后总下降率为25％，但病毒效价仍大于2560，可用于疫苗生产，说明该商毒在上述条件下保藏5－10年病毒是比较稳定的，不同保藏年限的病料批量生产疫苗，安全性和免疫保护率均达到100％。