绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化

分离大鼠大脑皮质及皮质下组织，经消化及机械吹打后，用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细胞系克隆；用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞(NSCs)。结果，从大鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖能力；原代和传代细胞抗原与抗巢蛋白(nestin)单克隆抗体反应呈阳性；单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明，用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

胎儿肝干细胞的分离培养与鉴定

从人胎儿肝脏中分离、纯化肝干细胞并进行鉴定。采用改进Seglen胶原酶原位灌注消化,结合Percoll密度梯度离心分离纯化胎儿肝干细胞,计数并测定细胞活性,光镜、电镜对其形态进行观察,用免疫细胞化学法(ICC)检测细胞表面标志表达情况。结果表明,所分离细胞活性率为90.80%±2.04%,细胞平均为(2.74±0.77)×107个/肝(n=10),光镜、电镜下观察其具有肝干细胞形态及超微结构特点,ICC染色,AFP、CK19、CK8及CD34等呈阳性,原代培养可形成肝干细胞集落。研究结果为人胎儿肝干细胞的存在提供了直接依据。     

西门塔尔牛表皮干细胞的分离培养与生物学特性研究

旨在建立西门塔尔牛表皮干细胞(epidermal stem cell, EpSCs)分离培养体系,探究其生物学特性,为西门塔尔牛种质资源保存提供新方法,为干细胞治疗研究提供种子细胞。采用3～4月龄西门塔尔牛背部表皮,通过酶消化法和组织贴壁法两种方法分离培养西门塔尔牛EpSCs,绘制EpSCs生长曲线探讨其增殖能力。通过免疫荧光鉴定EpSCs表面标记物(ITG β1、P63和CD71),通过RT-PCR分析EpSCs特异性基因(ITG β1、KRT19和ITG α6)表达情况。通过体外诱导EpSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞检测其分化潜能。结果显示,组织块贴壁法获得的EpSCs纯度较低,酶消法获得的EpSCs纯度较高,细胞传代至P28代时开始逐渐老化。EpSCs细胞生长曲线呈“S”型。免疫荧光结果显示EpSCs表面特异性标记物ITG β1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示EpSCs高度表达ITG β1、KRT19和ITG α6,不表达CD31基因。EpSCs诱导分化脂肪细胞时,产生可被油红O着色的脂滴,经鉴定细胞阳性表达脂肪细胞PPAR-γ和LPL特异性基因。Ep...     

猪胎儿神经干细胞的分离培养和分化

本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点.利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出神经干细胞,神经干细胞具有分化潜能.神经干细胞中Nestin表达强阳性,β-actin、DCX、Hesl、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果提示,从猪胎儿脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能.     

妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化

从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志.结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能.     

神经干细胞研究进展

综述了近年来神经干细胞在发生、迁移、移植、分化等和在治疗多种禊是经疾病上的潜在前景方面的研究进展。     

猪雄性生殖干细胞的分离培养及鉴定

本试验旨在探索猪雄性生殖干细胞(mGSCs)体外分离、培养的适宜条件,建立猪雄性生殖干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法对新生小猪睾丸生殖干细胞进行了体外分离和初步的培养鉴定,并利用层黏连蛋白和明胶的不同贴壁特性,比较2种差易贴壁分选方法的富集效果,并对传代后的干细胞培养1周后进行碱性磷酸酶染色鉴定,通过免疫荧光技术检测培养细胞是否表达干细胞标志蛋白OCT-4。试验结果表明,层黏连蛋白更适用于猪生殖干细胞的富集、培养,细胞分选效率及增殖生长明显优于采用明胶分选的方法。培养的mGSCs拥有与小鼠mGSCs相同的形态、增殖及表达特征。鉴定结果显示,生长细胞克隆碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性;培养的生殖干细胞克隆表达转录蛋白OCT-4,而饲养层支持细胞OCT-4抗体染色则呈阴性。结果表明培养的干细胞克隆仍保持较好的干细胞活性,保持正常的自我复制和分化潜能,初步建立了生殖干细胞培养体系。     

西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化

本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）体外分离培养体系,并对其生物学特性进行探讨,为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈,采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs,进行体外培养和冷冻保存,测定冻存前后细胞活率,MTT检测法绘制GMSCs生长曲线;通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1）,并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明,西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形;冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示,细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率,但均维持在85%以上,细胞生长曲线呈典型的S型;免疫荧光结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1,不表达CD31;PCR结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166,不表达CD34和CD45;流式细胞术结果显示,西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%）,几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）;成脂诱导分化后,可见大小不一的脂滴,脂滴可被油红O染色,且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）;成骨诱导分化后,可见被茜素红染色的矿化结节,且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上,本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs,建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系,并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能,结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。     

犬脂肪干细胞的分离培养与鉴定

为了研究脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养方法及其生物学特性,将ASCs应用于小动物临床治疗,本试验用犬进行了脂肪干细胞的分离、培养和鉴定。犬脂肪干细胞(Canine adipose-derived stem cells,cASCs)体外培养生长良好,呈细长梭形。第3代(P3)细胞诱导2周后,成脂诱导组经油红O染色可见细胞内脂滴积累;成骨诱导组经碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)及VonKossa染色,AKP、钙结节均呈阳性表达。第3代至第5代(P3^P5)细胞流式细胞检测结果显示,所分离细胞稳定高表达间充质干细胞(MesenchymalStem Cells,MSCs)标志CD29、CD44、CD90(>90%),不表达造血细胞标志CD45(<2%)。培养结果显示,从犬镰状韧带和皮下脂肪均可分离出cASCs。cASCs取材方便,易于体外培养,多次传代及冻存对cASCs的生物学性质无明显影响。eASCs有望成为国内动物医学临床研究和治疗的重要干细胞来源。     

猪原代神经细胞的体外培养与鉴定

为建立猪原代神经细胞体外培养及鉴定方法,本研究选取90日龄潜江黑猪1头,分离猪脑组织,无菌剪碎后采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备神经细胞悬液,进行培养,逐日在倒置相差显微镜下观察,并用间接免疫荧光鉴定。结果显示,培养72h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起变长并交错呈网络,培养至15~20d神经细胞状态最佳,随后逐渐老化,神经细胞可生长30d,经鉴定Nestin表达呈阳性。本研究建立的方法适合一般实验室开展猪原代神经细胞的培养与初步鉴定。     

Isolation of Chlamydia psittaci from an aborted bovine fetus

One strain of Chl. psittaci was isolated from two aborted foetuses of two cows coming from the same locality. Tissue from the lungs of the aborted foetuses was used for the isolation tests; after sample preparation this tissue was inoculated into the yolk sacs of chick embryos. It was found on the basis of serological examination (RVK) that both aborting cows had positive levels of antibodies against the Chl. psittaci antigen at a serum dilution ratio of 1 : 64. The serological examination for brucellosis (BAB) and coxiellosis was negative. The bacteriological examination (aerobic and anaerobic cultivation, salmonellae, mycoplasms and moulds) also gave negative results.     

牛源羊创伤球菌的分离鉴定

本实验从重庆某肉牛场肺炎患牛肺脏中分离一株革兰氏阳性双球菌,为进一步确定该菌株的分类地位,本研究对其进行细菌学分类鉴定。通过细菌培养特性、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等研究表明,该分离菌与羊创伤球菌(H.ovis)(CCUG37441)特性相近;其16S rRNA序列与H.ovis标准株同源性达99.8%。药物敏感性试验和动物试验表明,该菌对菌必治最敏感,不致死小白鼠。     

奶牛流产胎儿弯曲菌的分离鉴定

牛生殖道弯曲菌病(Bovine Genital Campylobacteriosis)是由胎儿弯曲菌引起的一种以不育、胚胎早期死亡及流产为特征的传染病。胎儿弯曲菌是一种微需氧的革兰氏阴性菌，分为胎儿亚种(C．fetus subsp．fetus)和性病亚种(C．fetus subsp．venerealis)。胎儿亚种引起牛散发性流产和羊地方流行性流产，也可感染人，引起流产、早产、败血症以及类似布鲁氏菌病的症状。性病亚种是牛生殖道弯曲菌病的病原，主要引起不育、胚胎早期死亡及流产，给奶牛业造成严重的经济损失。     

Functional identification of bovine mammary epithelial stem/progenitor cells

Veterinary Research Communications -     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。     

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0.2%中性蛋白酶Ⅱ和0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)两步酶消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基(K-SFM)培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示,细胞生长曲线表明,不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢,4⁶d进入倍增期,有无限增殖的趋势,所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征(体积小、立体感强),呈现未分化特征;CK19、CK15、β1-integrin和CD34免疫组化染色阳性;第3、5、7、9代克隆形成率分别为(32.7±2.27)%、(47.0±3.46)%、(46.3±3.18)%和(43.3±3.76)%。结果表明,用两步酶消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞,无血清角质细胞培养基(K-SFM)可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。