猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著（P〈0.05）,而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的致病性研究

为了了解猪丹毒丝菌安徽分离株(BB130818)对小鼠的致病性,试验采用改良寇氏法测定猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的半数致死量(LD50),应用1×LD50和100×LD50菌量分别攻毒感染小鼠,通过实时荧光定量PCR技术检测感染菌株在小鼠体内的分布情况,并采集以100×LD50剂量攻毒时小鼠的脾脏、肺脏、肝脏制作组织切片观察病理变化。结果表明:猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的LD50为50.3 cfu/m L;以1×LD50剂量攻毒36 h后即可从小鼠心脏、脾脏和脑组织中检出该菌,48 h后可从小鼠肝脏、肺脏中检出该菌;以100×LD50剂量攻毒24 h后即可从小鼠心脏、脾脏、肺脏和脑组织中检出该菌,36 h后可从小鼠肝脏中检出该菌;小鼠全身败血性出血,脾脏、肺脏、肝脏均出现病变。说明猪丹毒丝菌安徽分离株具有较强的致病力,进入小鼠体内的主要增殖器官首先是心脏、脾脏和脑组织,然后到肺脏和肝脏。     

单核细胞增多性李斯特菌人工感染小鼠致其脑炎模型的建立及优化

采用不同剂量单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monoc ytogenes,LM)LM90SB2腹腔注射感染小鼠219只,观察小鼠临床症状,纪录死亡情况,在感染后不同时间采集小鼠脑组织,进行脑组织中细菌回收、鉴定及病理组织学观察.结果显示,不同感染剂量感染小鼠,其临床症状和脑组织病理变化基本一致.但是随着感染剂量的增加,其临床症状出现时间逐渐缩短,死亡率和脑组织中细菌分离的时间明显不同.1/2LD50剂量组小鼠未出现死亡,2/3LD50组和LD50组死亡率分别为12.5％和63.3％;另外1/2LD50组感染后24 h开始从脑组织中离到LM,96 h所有感染小鼠脑组织均能分离到LM,2/3LD50组感染后12h开始能分离到LM,72 h所有脑组织均能分离到LM.从小鼠临床症状及死亡率、脑组织细菌的回收情况和脑组织病理组织学变化综合考虑,以2/3LD50 LM LM90SB2 腹腔感染小鼠为动物感染模型.     

冷冻鸡肉中单核细胞增生李斯特菌2个分离株的毒力及毒力相关因素研究

以鸡胚为感染动物,检测2株冷冻鸡肉单核细胞增生李斯特菌(LM)的鸡胚半数致死量(LD50)、鸡胚肝脏指数、确定其毒力,同时检测毒力基因、溶血价、生物被膜形成能力,进行毒力相关因素分析.结果显示,与PBS组和无害李斯特菌(L.innocua)组相比,LM873与LM925均能致死鸡胚,鸡胚LD50分别为4.733和1.5...     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫攻毒模型的建立

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pm)是典型的条件致病菌,为建立该病原菌的免疫攻毒模型,本研究采用不同代次、不同剂量的Pm-TJ株接种实验动物小鼠和本动物牛,测定其对小鼠的最小致死剂量以及对牛的最小感染剂量;在此基础上,将制备的全菌体灭活疫苗分别免疫小鼠和牛,通过攻毒保护试验评价该疫苗对动物的免疫原性。攻毒试验结果显示,Pm-TJ株对小鼠高度致死,最小致死剂量为10 cfu,而且不同代次细菌的毒力无显著差异,表明其在体外传代过程中毒力保持稳定;能够引起Pm-TJ株接种牛典型的纤维素性化脓性肺炎,而且接种牛的发病率呈现剂量依赖性,最小感染剂量为2.5×10~8 cfu。免疫后攻毒试验结果显示,将含有1×10~7 cfu灭活菌体的疫苗接种小鼠,其能够抵抗致死剂量细菌的攻击;用含有7.5×10~9 cfu灭活菌体的疫苗接种犊牛,用两倍最小感染剂量细菌攻击,免疫牛能够获得有效保护。本研究利用实验动物小鼠和本动物牛建立了牛荚膜A型Pm的免疫攻毒模型,并表明该全菌体灭活疫苗具有良好的免疫原性,这些研究结果为Pm疫苗的研发奠定了实验基础。     

单增李斯特菌内化素基因inlG基因原核表达及小鼠免疫保护性分析

为研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)内化素基因inlG编码蛋白的免疫原性和免疫保护效果,以标准株ATCC19111菌株基因组为模板,参照GenBank上inlG基因序列设计特异性引物,运用PCR方法扩增inlG基因,构建重组质粒pET-28a(+)-InlG,将其转化至表达菌BL21(DE3),加IPTG后优化表达条件进行SDS-PAGE分析,Western blot分析抗原性。接着将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后皮下注射小鼠,免疫后测定效价,以单增李斯特菌进行攻毒试验,统计小鼠存活率来研究对小鼠的免疫保护效果。结果:扩增出inlG基因全长约为1 473 bp,inlG基因编码490个氨基酸;成功构建重组质粒且表达出相对分子质量约70 ku的蛋白,目的蛋白在上清中表达量较好;Western blot结果表明InlG蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白免疫小鼠后小鼠效价达到1∶52 000以上,具有良好的免疫原性;用2倍半数致死量的LM菌液腹腔感染小鼠,免疫蛋白组小鼠死亡一半,小鼠存活率远远高于未免疫组(6.25%),表明InlG蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。本研究为进一步探讨inlG基因生物学功能奠定基础。     

检测鸡球虫四价弱毒疫苗抗体应答的ELISA方法的建立及初步应用

本研究旨在建立检测鸡球虫四价弱毒疫苗(柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫)抗体应答的酶联免疫吸附试验(ELISA),并初步阐明鸡免疫四价弱毒疫苗及攻虫后的抗体应答。将300羽岭南黄鸡分为A(免疫攻虫组)、B(不免疫不攻虫组)、C(不免疫攻虫组)共3个组。A组雏鸡在4日龄时进行首免,11日龄时鸡开始二免,二免完成后(17日龄时)对A组及C组的鸡进行攻虫(28万个4种球虫的混合卵囊/羽),7 d后检查A、C两组鸡的存活率。在鸡二免和三免完成后,分别对A、B组进行采血,通过优化最佳抗原包被浓度、酶结合物工作浓度及最佳血清稀释度,建立了ELISA方法来检测鸡体对球虫四价弱毒疫苗的抗体应答情况。A组鸡血清抗体的平均D值为0.870和0.904,明显高于B组鸡的平均D值0.261和0.270,证明了鸡体免疫疫苗后可以刺激产生相应抗体。免疫鸡攻虫后的存活率和抗体应答的检测结果,都充分说明了此鸡球虫弱毒四价疫苗具有良好的免疫原性,所建立的ELISA方法为今后评价鸡球虫弱毒四价疫苗的免疫效力提供了有效手段。     

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD₅₀)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰ CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD₅₀;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD₅₀剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD₅₀为10^9.25 CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础。     

评价牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力BALB/c鼠模型的建立

为建立评价流产布鲁氏菌疫苗株免疫保护力的小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,随机分为3组(n=40):A19免疫攻毒组、非免疫攻毒组和PBS对照组。A19免疫组腹腔接种BALB/c鼠A19 5.0×10⁴ CFU,非免疫攻毒组和PBS对照组均接种PBS液0.2 mL。免疫后45 d,A19免疫攻毒组和非免疫攻毒组BALB/c鼠以3.0×10⁴ CFU剂量的2308强毒株攻击,攻毒后15和45 d分别剖杀小鼠,取小鼠脾脏称重、细菌分离、病理组织学检测。结果表明,攻毒后15 d,A19免疫攻毒组与未免疫攻毒组和PBS对照组之间克脾指数差异显著(P<0.05);攻毒后45 d,A19免疫攻毒组与PBS对照组的克脾指数差异不显著(P>0.05),与未免疫攻毒组克脾指数差异显著(P<0.05);免疫攻毒组的小鼠组织病理变化明显轻于未免疫攻毒组。结果表明,用BALB/c鼠为试验动物,以A19为疫苗参考株建立动物实验模型可以应用于牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力评价。     

EHEC O157 △ler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)对小鼠免疫保护作用的实验研究

通过粘膜免疫途径对基因工程菌EHEC O157Δler/stx（pBR322：：stx1/2B：：eae）进行小鼠免疫保护作用实验研究。结果表明,用EHEC O157Δler/stx（pBR322：：stx1/2B：：eae）灌胃免疫小鼠能够诱导小鼠产生抗EHEC O157特异性免疫应答,两次免疫后7d,免疫组血清IgG抗体显著高于对照组,14 d检测IgG抗体达到最高峰,粪便中检测到高水平的抗EHEC O157特异性IgA抗体,表明该工程菌可以诱导肠道粘膜免疫应答和系统免疫应答。EHEC O157强毒株经胃肠道途径攻毒后,一次免疫组和两次免疫组小鼠存活率（67%和78%）均高于未免疫组（50%）;免疫小鼠强毒菌排菌时间大大缩短,两次免疫组攻毒后第5 d检测不到强毒菌,未免疫组排菌达10 d以上;攻毒后免疫组小鼠体重较快恢复正常水平。     

猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗免疫抗体水平分析

为评估猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗的免疫原性,用商品化的乙型脑炎鼠脑疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗(SA14-14-2株)以及自制乙型脑炎细胞灭活疫苗(HW1株)分别免疫仔猪,通过抗体水平监测试验、中和抗体试验、小鼠攻毒保护试验分别检测了其特异性抗体消长情况、中和抗体效价产生情况及疫苗对小鼠的攻毒保护率。结果显示,3种疫苗均能产生中和抗体,乙型脑炎细胞灭活疫苗免疫组中和抗体水平要高于鼠脑疫苗和弱毒疫苗免疫组,乙型脑炎细胞灭活疫苗和弱毒疫苗免疫组对小鼠的攻毒保护率高于鼠脑疫苗免疫组,但两者之间差异不显著。抗体消长情况显示,至8周观测期结束,鼠脑疫苗免疫组的抗体阳性率为80%,乙型脑炎细胞灭活疫苗和弱毒疫苗免疫组抗体阳性率为100%。结果表明猪乙型脑炎(HW1株)细胞灭活疫苗的免疫原性优于鼠脑灭活疫苗和弱毒疫苗。     

重组产单核细胞李斯特菌溶血素的应用研究

李氏杆菌溶血素(Listeriolysin,LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子,为探索LLO的免疫保护性和作为诊断抗原的可行性,本研究用重组LLO抗原和单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)全菌分别免疫BALB/c小鼠和家兔,定期采血,ELISA检测抗LLO的抗体水平,并分别对免疫和对照动物攻毒致死剂量的LM,分析重组LLO抗原的免疫保护性。结果表明,小鼠和家兔在二免后10~20 d内LLO的抗体即可达到峰值,而且免疫动物能有效抵抗LM的感染。因此,重组LLO不仅可以用作动物LM的诊断抗原,而且具有作为基因工程疫苗的潜力。     

D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的研制及保护效果的评价

为研制更有效的预防家畜D型产气荚膜梭菌肠毒血症的疫苗,本研究采用D型产气荚膜梭菌标准菌株增菌培养,经自制产毒培养基高效产毒,制备成D型产气荚膜梭菌氢氧化铝类毒素疫苗和白油类毒素疫苗。通过不同剂量疫苗免疫绵羊的攻毒保护试验和免疫绵羊的抗体水平监测,评估疫苗的免疫保护效果。结果表明:D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗安全性良好,氢氧化铝苗和白油苗对绵羊有效免疫剂量均为4 m L(外毒素对小鼠半数致死量为2-6.4/m L),绵羊接种一个有效免疫剂量后,氢氧化铝疫苗免疫保护周期为6周以上;白油疫苗免疫保护周期为21周以上。本研究结果表明两种疫苗均具有良好的应用前景。     

布鲁氏菌A19株菌影疫苗的构建及其免疫效果评价

为开发一种安全有效的布鲁氏菌疫苗,解决现有A19、S2和M5等弱毒疫苗存在较强毒力可感染人,且无法通过血清学方法将其免疫抗体与野毒感染抗体进行鉴别区分的问题,本试验将含有噬菌体PhiX174裂解酶基因E的质粒转化至A19疫苗株,构建菌影疫苗(A19-BG)菌株,并检验其遗传稳定性及对小鼠的安全性、免疫效果和保护效果。结果显示,构建成功的A19-BG菌株传代20代仍稳定,热诱导48 h后可完全灭活,菌体穿孔明显。A19-BG疫苗免疫小鼠7 d后免疫部位无不良反应,14 d后脾脏无可见病理变化,与空白对照组相比脾脏重量无显著差异(P>0.05)。一免和二免后14 d,免疫小鼠的布鲁氏菌抗体、白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平持续升高,产生了良好的体液和细胞免疫反应。布鲁氏菌2308强毒株攻毒免疫小鼠,免疫保护率可达87.5%,保护效果良好。结果表明,构建的A19-BG疫苗具有良好的稳定性、安全性、免疫效果和保护效果,有望成为一种极具潜力的布鲁氏菌新型疫苗。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株的筛选及灭活油乳剂疫苗的研制

血清2型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)分离株经雏鸭体内复壮、回收、鉴定后,选取其中2株细菌NJ3和Yb2进行毒力测定,结果表明其半数致死量分别为5.62×107CFU和1.07×105CFU。选取5株细菌制备灭活油乳剂疫苗后免疫鸭,并进行攻毒保护试验。结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性ELISA抗体和攻毒保护力,但是攻毒保护性差异较大,NJ3免疫后的攻毒保护性最好。抗体检测及攻毒保护实验表明NJ-3是较理想的制苗用菌株。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。     

鱼精蛋白对大肠杆菌急性感染小鼠的保护作用研究

为探究鱼精蛋白(PP)对大肠杆菌(E. coli)急性感染小鼠的保护作用,本研究将20只小鼠随机分为2组,每组10只,PP组皮下注射PP 100μg/0.2 mL/只,对照组皮下注射等体积生理盐水,7 d后采用致病性E. coli攻菌,观察小鼠的发病和死亡情况;同时,将16只小鼠随机分为2组,每组8只,按照上述方法皮下注射PP后攻菌,分别于攻菌12 h,24 h采集眼眶血,迫杀后无菌采集部分小鼠肝脏、脾脏,采用活菌计数法检测攻菌后小鼠外周血、脾脏、肝脏中的细菌载量,利用试管定量显色基质法检测小鼠外周血脂多糖(LPS)含量,利用动物生化分析仪进行血液生化检测;采用qRT-PCR方法检测攻菌后48 h小鼠脾脏中IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、NF-κB、IRF3、IRF7等炎症相关因子的mRNA转录水平。结果显示,与对照组比较,PP能极显著提高攻菌小鼠的存活率(p0.01);亚剂量攻菌后,PP能极显著降低小鼠外周血、脾脏、肝脏中的细菌载量,极显著降低小鼠外周血中LPS含量以及血清谷丙转氨酶(ALT)含量(p0.01)。同时,PP能显著降低攻菌所致的与LPS-TLR4通路相关的细胞因子(TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IRF7、IFN-β)mRNA转录水平(p0.05)。以上结果表明PP注射后7 d可对E. coli急性感染小鼠提供较好的保护作用,这可能与PP通过增强机体对细菌清除能力,从而有效控制E. coli感染后的病程发展有关。本研究为PP临床防治E. coli急性感染的应用潜力探究提供了实验依据。     

布鲁氏菌VirB8变异株的构建及其感染力和毒力的测定

作者拟对缺失致病力因子--四型分泌系统中的VirB8基因后布鲁氏菌感染力和毒力的变化进行测定与分析.首先,构建了布鲁氏菌VirB8基因缺失株(△B8B.suis),用缺失株感染巨噬细胞和BALB/c小鼠,再用B.suis强毒攻击BALB/c小鼠并检测脾脏含菌数,观察其在动物体内定居能力、毒力及抗感染保护力.鉴定△B8B.suis为VirB8基因完全缺失株,△B8B.suis感染巨噬细胞6、24和48 h,其CFU分别为49、165和355;△B8B.suis感染BALB/C小鼠的每克脾含菌数为3.6×107(1×108CFU腹腔接种)和5×106(1×109CFU蹊部接种);BALB/c小鼠攻毒试验显示△B8B.suis免疫组每克脾平均含菌数为7.61×102,非免疫对照组为2.98×105.结果表明布鲁氏菌缺失VirB8基囚后,其毒力较亲本株弱,但能在小鼠脾脏定居,为弱毒株;△B8B.suis呈现出作为疫苗的生物学特性,但毒株能否作为疫苗株使用,还需进一步验证.     

PCV2a/2b灭活疫苗与PCV2b亚单位疫苗免疫效力比较试验

比较猪圆环病毒(PCV)2a、PCV2b基因型全病毒灭活疫苗和PCV2b亚单位疫苗对PCV2b基因型强毒株免疫攻毒保护效力。取3种类型PCV2疫苗,分2次免疫PCV2抗原和特异性抗体阴性的BALB/c小鼠和14日龄仔猪,间隔21d,分别于免疫后14、21和35 d进行PCV2特异性ELISA抗体测定。使用临床分离鉴定的PCV2b基因型强毒株进行攻毒,通过攻毒前后临床观察、体温变化、平均相对日增重及PCV2核酸载量检测等对疫苗免疫效果进行评价。结果:不同类型PCV2疫苗免疫BALB/c小鼠后14 d能检测到PCV2特异性抗体,在35 d时抗体水平持续升高,其中PCV2b亚单位疫苗产生抗体水平高于全病毒灭活疫苗;不同类型疫苗均能刺激仔猪产生较好的免疫应答,其中PCV2b亚单位疫苗刺激机体免疫应答强于灭活疫苗;仔猪免疫攻毒试验表明,3种类型疫苗均可刺激机体产生抵御PCV2强毒攻击的特异性免疫应答,免疫组体温变化、相对日增重及PCV2核酸载量检测均与攻毒对照组间存在显著性差异,3种类型疫苗之间差异不显著。试验表明:3种类型PCV2疫苗免疫小鼠和仔猪后均能诱导产生抵御PCV2b基因型强毒攻击的特异性免疫应答反应,有效抵抗PCV2感染和提高猪的生长性能。     

减毒鸡沙门菌疫苗株97A的免疫保护效力试验

减毒沙门菌疫苗株97A免疫鸡经鸡沙门菌强毒株Sg9攻击后,对免疫攻毒组和攻毒对照组鸡进行病理学检查和细菌分离,以进一步评价97A疫苗的免疫保护效力。结果表明,免疫攻毒组鸡肝脏、肺脏和肾脏等实质器官仅有轻到中度的炎症反应,而攻毒对照组鸡则表现出了严重的组织病理学变化,同时减毒鸡沙门菌疫苗株97A能显著地限制强毒株在鸡体内的定居和增殖,显示出了良好的免疫保护效力。