鹅细小病毒侵染雏鹅组织器官的氧化/脱氢酶及同工酶研究

酶是催化代谢途径的高效活性基因产物,应激环境和遗传基础的不同导致同工酶结构或活性差异,使不同组织和发育阶段的酶种类和活性表现特异性变化。采用生化分析试验技术和PAGE分析鹅细小病毒(GPV)感染雏鹅氧化/脱氢酶(LDH、ADH、POD、CAT)的活性及同工酶特征变异,结果表明,GPV感染雏鹅的脑、心脏、脾脏组织新出现1条POD同工酶谱带,肺脏组织消失1条同工酶谱带;GPV感染雏鹅的肝脏、脾脏组织分别缺失慢区3条和1条CAT同工酶谱带;GPV感染雏鹅组织器官的LDH和ADH同工酶仅显示1~2个慢区带,肺脏缺失1条慢区ADH同工酶谱带,ADH活性降低了13.61%~61.08%,心脏增高1.2倍;POD、CAT、LDH活性分别增强1.2~6、1.5~3.5、2~2.5倍,而脑、肺脏的CAT活性降低了40.29%和94.68%,心脏、肺脏的LDH活性降低了75.93%和91.81%。提示氧化/脱氢酶产生的广泛变异是GPV感染应激与宿主氧化/脱氢酶基因表达的互作效应,其酶的谱型、活性等生化特征变异,直接或间接调控代谢途径、影响生理机能及病理性能,敏感的氧化/脱氢酶是研究病毒基因型与宿主遗传易感性互作病理学机制的有效标记物。     

鹅细小病毒感染雏鹅血液的蛋白/酶活性及同工酶变异性研究

为了解鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)侵染的病理学致病机理,探究蛋白/酶的分子变异特征,本研究对GPV感染雏鹅血液中的蛋白质、保护酶、蛋白酶活性及其同工酶结构和功能等进行了生化—分子生物学分析.结果显示,GPV感染雏鹅的血液中(血浆和血细胞)蛋白酶活性和蛋白质含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及酯酶(Est)活性分别是对照组的1.46和1.63、1.51和1.49、1.50和1.14、1.36和1.73、1.30和1.53倍.GPV感染雏鹅的血浆中,SOD同工酶增加了2条谱带(134和239);Est同工酶增加2条快区主带,减少了2条慢区谱带;酶蛋白减少1条慢区谱带(304);蛋白质新增加4条主带(131、86、43、33 ku).而血细胞新出现2条POD同工酶谱带(93和203),分别增加了1条(160)中区SOD同工酶谱带、1个快区Est同工酶谱带、2个慢区酶蛋白谱(223和330)和4个蛋白主带(144、104、58、53 ku).提示GPV感染应激与寄主基因表达的蛋白质、保护酶、蛋白酶及同工酶相互网络协作会引起酶的谱型、活性等生化特征变异,直接或间接调控代谢途径与病理生化性能,增强机体对入侵GPV的防御应激性能.因此,蛋白质、保护酶、蛋白酶及同工酶是GPV感染的应激靶标,可作为雏鹅易感GPV致病机制研究的有效标记.     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒(GPV)B株的全基因序列，针对GPV的VP3保守基因设计了1对引物，建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约441bp的特异性片段，而对鸭瘟病毒(DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌(E．coli)Os和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达0．47pg；对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明。感染后8h即可从心、肝病料中栓出病毒DNA，感染后24h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中栓出GPVDNA，感染48h后可从骨髓中检出病毒DNA，感染312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性，对，临床送栓病料的检测结果表明，PCR的敏感性显著高于病毒分离。     

板蓝根多糖抗小鹅瘟病毒的作用

在鹅胚内用板蓝根多糖(IRPS)作直接杀毒和阻断感染试验,对鹅胚尿囊液中小鹅瘟病毒(GPV)含量、鹅胚存活时间、存活率、病变和免疫组化进行测定。结果显示,40μg/胚IRPS阻断感染组,GPV接种后72h ELISA检测为阳性的尿囊液最高稀释倍数23;鹅胚平均存活时间192h;存活率6/6;胚体肉眼观察未见病变;切片镜检可见肝、肾轻度淤血和细胞变性,心、脑轻度淤血和水肿;免疫组化显示肝、肾内GPV表达抗原为弱阳性,心、脑内为阴性。而攻毒对照组尿囊液GPV阳性的最高稀释倍数28;鹅胚存活时间138h;存活率0/6;胚体严重萎缩、出血、水肿,各组织细胞碎裂、坏死,组织内GPV表达抗原全为强阳性。两者比较,各指标具有极显著差异。这表明在鹅胚内IR-PS具有极强的阻断GPV感染、增殖和保护胚体组织器官免受其损伤的作用。     

卫星搭载和PEG胁迫对苜蓿愈伤组织两种抗氧化酶的影响

为了进一步研究卫星搭载对苜蓿同工酶的影响,试验对卫星搭载和未搭载的苜蓿愈伤组织进行聚乙二醇(PEG)胁迫,测定过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及同工酶酶谱的变化。结果表明:卫星搭载和PEG胁迫均显著提高了苜蓿愈伤组织POD和SOD活性(P0.05)。卫星搭载的苜蓿愈伤组织POD和SOD同工酶比未搭载分别增加1,2条酶带;经PEG胁迫后,卫星搭载的苜蓿愈伤组织酶谱带均增加1条。说明卫星搭载和PEG胁迫可以提高苜蓿愈伤组织的抗旱性。     

基因枪轰击不同剂量小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在雏鹅体内的动态分布

本文开展了检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法的建立和基因枪轰击不同剂量(1、3和6μg)GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)在30日龄四川白鹅体内(心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、血液、脑及注射部位皮肤)分布规律的研究。结果表明:①建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值相关系数达到0.999,具有很好的直线相关性;②pcDNA-GPV-VP3各剂量免疫雏鹅1 h即可在各组织中检测到,其中注射部位含量最高,肝、肾、淋巴器官(脾、法氏囊、胸腺、哈氏腺)含量较高;③到免疫后217 d时,1μg组免疫雏鹅各个组织器官内仍检测到pcDNA-GPV-VP3的存在,但多数组织器官中的含量比1 h时约少了4个数量级,其中免疫部位减少了7个数量级;④血液中pcDNA-GPV-VP3的含量较少,且免疫后1 h~217 d各时间点的差异不显著(P≥0.05);⑤不同剂量pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅各组织中的含量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,但差异不显著(P≥0.05)。因此,FQ-PCR是定量检测pcDNA-GPV-VP3在免疫雏鹅体内含量的可靠方法,pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后1 h时可分布至雏鹅体内各组织器官中并持续存在217 d以上。     

免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究

利用免疫酶组织化学染色法将雏鹅进行人工感染GPV,在不同阶段病毒抗原在体内的分布状况具有不同的特点,采用影像学技术对其予以定量分析后,雏鹅于感染1～21 d可在各器官中检测到病毒抗原体,而其中在5 d时,感染分布较为广泛,因此抗原出现染色效应的最大,待检组织中空肠具有较高的检出率,而病毒抗原因此广泛存在消化道的各种上皮细胞中,由此可知上皮细胞为GPV重要的靶细胞。     

一例小鹅瘟的诊断与防治

小鹅瘟又称德舍氏病,是由鹅细小病毒(GPV)引起雏鹅和雏番鸭的1种急性或亚急性败血性传染病,主要侵害3~20日龄小鹅,以渗出性肠炎、肝、肾、心等实质器官炎症为主要特征。该病传染快、发病率和死亡率高,是严重危害养鹅业的传染病。     

雏鹅人工感染沙门菌的病理组织学观察

为了研究沙门菌感染雏鹅的主要病理组织学变化。采取腹腔注射沙门菌人工感染7日龄健康雏鹅,对发病雏鹅进行病理剖检,并采取肺脏、肝脏、脾脏和肠道病料制作病理切片,光学显微镜下进行病理组织学观察。受感染雏鹅剖检病变可见皮下、心肌、肺脏、脾脏、肠道、脑膜等多处出血,肝脏坏死,胆囊、脾脏肿大;显微病理组织学变化为肝、脾、肺、肠道等器官出血、细胞变性、坏死,有炎性细胞浸润。结果表明,感染沙门菌雏鹅出现了广泛性的组织损伤,同时伴随着机体各器官明显的炎症反应。     

鹅细小病毒感染雏鹅的主要组织相容性复合体变异性研究

为了探究MHC基因的多态性与抗病性之间的相互关联作用。采用GPVYZ感染雏鹅,经Triton X-100分级分离MHC,将Sephadex G-200凝胶柱在Bio Gel P-100凝胶柱色谱工作站上串联,分步聚集纯化鹅肝脏MHC,SDS-PAGE分析鉴定。结果显示,初级分离的MHC主带区为30~90 ku、35 ku、20 ku,纯化的鹅肝脏MHC的特征蛋白带是30 ku,33 ku,40 ku,42 ku低分子量蛋白,与MHC类分子重链/α和轻链/β一致,提示重链与轻链折叠形成多态性MHC类分子,可作为致病研究的候选标记基因。YZ0明显缺失84 ku、61 ku蛋白主带,YZ组明显缺失45 ku蛋白峰p2和42 ku蛋白峰p1特征带,新增加34 ku峰p2和38 ku蛋白峰p1带;提示GPV感染与鹅肝脏MHC基因表达蛋白发生相互作用,45 ku、34 ku MHC是GPV的敏感蛋白,42 ku、38 ku蛋白带也与GPV的感染密切相关,MHC重链基因是GPV的易感基因。