大肠杆菌O157:H7 Z3955蛋白的亚细胞定位分析

α-淀粉酶是一种广泛存在的淀粉分解酶，催化淀粉和相关α-葡聚糖中α-1,4-葡萄糖苷键的水解，它可以定位在不同细菌的不同位置。大肠杆菌O157:H7 Z3955基因的同源基因在非致病性大肠杆菌编码α-淀粉酶，可以确定Z33955蛋白的准确定位。PCR扩增大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株的Z3955基因，扩增的基因片段连接pGEX-6P-1载体构建重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，表达重组蛋白GST-Z3955,并用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化。纯化的GST-Z3955免疫BALB/c小鼠产生抗血清。利用GST-Z3955蛋白的抗血清检测Z3955在细菌中的亚细胞定位。最终成功构建了能表达目的蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)-pGEX-6P-1-Z3955重组菌。用纯化的重组GST-Z3955蛋白免疫小鼠，获得了Z3955多克隆抗体。免疫印迹确定Z3955抗血清的最佳工作浓度为1∶12 500。Z3955定位在大肠杆菌O157:H7的胞质、内膜、细胞周质和外膜，但不能分泌到细胞外。Z3955蛋白的亚细胞定位鉴定将有助于该蛋白的功能研究，并有助于了解Z3955在大肠杆菌...     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

大肠杆菌O157∶H7独有基因z3276的表达及初步鉴定

经BLAST分析表明,开放阅读框z3276是大肠杆菌O157∶H7独有的遗传标志性基因,编码氨基酸与大肠杆菌Ⅰ型菌毛有较高的同源性,但z3276基因编码蛋白的生物学特性尚不明确。为了明确z3276基因编码蛋白的抗原性,进一步研究其在大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用。采用PCR方法扩增z3276基因,去除其信号肽序列,克隆到原核表达载体pColdⅠ,转化感受态细胞BL21获得阳性重组菌,IPTG诱导表达重组蛋白,以大肠杆菌O157∶H7全菌抗血清为一抗,Western blot方法检测重组z3276蛋白抗原性。结果显示,成功构建重组菌BL21(pColdⅠ-z3276),并获得高效表达;相对分子质量33 000,占菌体总蛋白30%以上,主要以包涵体形式存在于菌体沉淀中;且与兔源全菌多克隆抗血清发生特异性反应,条带明显。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白.融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体.3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3 200.Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应.应用3株单抗均可特异性检出EHEC O157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应.     

狐肺炎大肠杆菌HtrA蛋白原核表达及多抗血清制备

利用PCR方法从银狐大肠杆菌基因组中克隆出htra基因,测序无误后将其构建到pET32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot方法验证重组蛋白得到很好表达;用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别大肠杆菌HtrA蛋白,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定基础。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。     

五重PCR检测大肠杆菌O157:H7菌体抗原和毒素基因

针对O157：H7大肠杆菌O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应，而单一毒素基因并不是O157：H7所独有这一特点，建立了五重和四重PCRA-法，同时检测大肠杆菌O157：H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157：H7，并有较高的特异性，解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低，并有交叉反应等问题。     

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测试剂盒的研制

为了研制一种快速、准确诊断大肠杆菌O157:H7的PCR方法,试验根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列,设计并合成了2对可扩增rfbE(O157)和Flic(H7)基因片段的特异性引物,建立双重PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明:该检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7能特异性地扩增出rfbE和Flic基因的目的片段;对大肠杆菌O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19只能扩增出rfbE而不能扩增出Flic基因的目的片段;对大肠杆菌DH5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段;细菌DNA的最低检测极限是50 pg;在-20℃条件下保存1,3,6,9,12个月后,其敏感性都没有发生改变,均能检测到50 pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板。     

猪瘟病毒Core蛋白的原核表达和抗体制备及应用

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体p ColdⅠ中,成功构建了重组质粒p Cold-Core,并转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中;利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导24 h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20 ku。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带,经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应。结果表明,Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。本研究为深入探讨Core蛋白在猪瘟病毒致病机制上的作用奠定了基础。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。