靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。     

麒麟鸡Frizzled4基因的miRNA筛选及验证载体构建

研究利用生物信息学方法选出调控Fzd4基因的miRNAs,且利用q RT-PCR方法检测了卷羽麒麟鸡和片羽怀乡鸡中miRNAs和Fzd4基因表达水平,进一步构建了Fzd4基因双荧光素酶报告基因pmir Glo载体,为后期在细胞水平验证miRNA和Fzd4靶标关系提供条件。结果显示:Fzd4基因的CDS区存在miRNA-1458(mi R-1458)和miRNA-1623(mi R-1623)靶标结合位点,与经典的调控机制有所不同,其3′UTR存在miRNA-184-3p(mi R-184-3p)结合位点;相对于怀乡鸡,麒麟鸡皮肤中mi R-1458、mi R-1623和Fzd4基因表达水平极显著升高(P0.01),而mi R-184-3p表达量极显著降低(P0.01);构建了Fzd4基因双荧光素酶报告载体,为细胞水平研究其具体调控机制奠定基础。研究表明Fzd4基因的关键miRNA为mi R-184-3p以及Fzd4基因双荧光素酶报告载体的构建为进一步研究其在毛囊生长发育过程的作用奠定基础。     

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

miR-194-5p靶向调控BCKDHA基因的表达

旨在预测并验证调控支链氨基酸分解代谢的限速酶支链α-酮酸脱氢酶复合体(Branched-chainα-ketoacid dehydrogenase complex,BCKDH)中α亚基即BCKDHA基因表达的关键miRNA。本研究利用3个在线软件预测与该基因具有靶标关系的miRNAs。利用荧光定量PCR检测小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中和超表达后关键miRNA与BCKDHA的表达量。结果表明,miR-194-5p是调控BCKDHA表达的一个关键miRNA,其种子序列与BCKDHA3′UTR第190~196位碱基完全互补。MiR-194-5p的表达随分化时间呈下降趋势,而BCKDHA mRNA则呈上升趋势。双荧光素酶报告结果也显示二者具有靶标关系,miR-194-5p下调BCKDHA的表达。超表达miR-194-5p后,BCKDHA的表达显著下调(P0.05)。由此证明,miR-194-5p通过与BCKDHA基因3′UTR结合抑制其表达。     

牦牛miR-101的靶基因预测及生物信息学分析

本研究利用相关生物信息学软件和数据库对牦牛miR-101进行了靶基因预测与生物信息学分析。通过高通量测序获取牦牛miR-101的序列,并分析其序列保守性;选取TargetScan、miRanda、PicTar预测结果的交集并结合miRTarbase中已证实的靶基因集合,取二者并集,采用BINGO和DAVID数据库获得靶基因集合的本体注释,进行GO功能富集及Pathway信号通路富集分析。结果显示,miR-101序列在各物种间高度保守,miR-101调控的靶基因GO功能富集主要包括多细胞生物体发育、发育过程、系统发育、解剖结构发育、器官发育等基本生物学过程和蛋白连接、转录因子活性等分子功能;靶基因存在于细胞各个组分中,包括细胞质、细胞核、细胞器中;信号转导通路显著富集于MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、黏着斑（focal adhesion）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）、TGF-beta信号通路（TGF-beta signaling pathway）和mTOR信号通路（mTOR signaling pathway）中（P<0.05）。通过对牦牛miR-101靶基因的生物信息学分析,为进一步研究miR-101在牦牛肌肉发育中的作用奠定基础。     

不同年龄马睾丸组织中miRNA-34家族含量的变化

为研究microRNA(miRNA)-34家族在马不同发育阶段睾丸组织内的表达规律,应用实时荧光定量PCR方法,以GAPDH作为内参基因,分别对miRNA-34家族(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在3个发育阶段哈萨克马睾丸组织表达情况进行检测。结果表明miRNA-34a在马睾丸发育过程中表达量较为稳定,在不同发育阶段睾丸组织内无显著差异(P0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在马驹和周岁马睾丸组织中的表达量较低,在这两个年龄段表达量无显著差异(P0.05)。而在成年马阶段出现明显上升,成年马miRNA-34b和miRNA-34c表达量与马驹和周岁马表达量有极显著的差异(P0.01)。位于同一基因簇上的miRNA-34b和miRNA-34c具有极为类似的表达模式和结构,分析认为马的miRNA-34b和miRNA-34c也具有冗余功能。     

miRNA-205在猪卵母细胞成熟过程中表达规律及其调控作用的研究

The research aimed to assess the expression profile and regulatory functions of miRNA-205 in pig oocyte in vitro maturation. The potential target of miRNA-205 was predicted by biology software including TargetScan and microRNA.org. The expression profile of miRNA-205 and its target gene were detected by Real-time PCR in pig cumulus-oocyte complexes(COCs) in vitro maturation 0, 24 and 48 h. The expression of miRNA-205 in pig COCs maturation gradually increased, 0 h lowest, 48 h maximum. The expression of miRNA-205 was significantly reduced in mature solution added EFG, FSH and LH compared with which in a basic mature solution, the expression of PTX3 and cumulus proliferation-related genes including TNFAIP6 and HAS2 were significantly increased. The expression of PTX3 was negative correlation with that of miRNA-205 in porcine oocyte maturation. From these results could be concluded that the miRNA-205 conserved sequence specifically bound to 3′-UTR region of PTX3 gene might be participated in the regulation of oocyte maturation.     

miRNA-148a-3p的生物信息学分析及其在小鼠不同组织中的表达水平检测

旨在研究小鼠不同组织中miR-148a-3p的表达情况,并对其进行生物信息学分析,构建miR-148a-3p基因相关网络,进一步阐明其在机体中的作用.本研究以6周龄雄性C57BL/6 J小鼠胃、肺、脾、皮肤、肝、心和肾7个组织为研究材料,每组3个重复,进行3次平行试验.利用qRT-PCR技术比较小鼠不同组织中miR-1...     

绵羊miRNA-1185-5p的基因组定位、靶基因预测和功能分析

miRNAs是一类小分子非编码RNAs,在机体许多生理及病理过程中发挥调控作用。该课题组前期研究发现,miRNA-1185-5p在经产双羔母羊卵巢中表达水平显著低于经产单羔母羊。为进一步深入挖掘miRNA-1185-5p在绵羊生殖过程中的作用,利用生物信息学手段分析了miRNA-1185-5p的基因组定位,预测其靶基因,并对靶基因进行GO功能分析。结果表明,miRNA-1185-5p是位于绵羊18号染色体的内含子miRNA;利用miRDB和microT 2种方法预测获得miRNA-1185-5p的23个靶基因,这些靶基因主要参与细胞增殖、分化和凋亡过程以及代谢等生物学过程,其中,靶基因AhR直接参与生殖过程。该研究说明miRNA-1185-5p可能通过作用于AhR等靶基因对绵羊生殖过程发挥调控作用。     

miRNA-125b在牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

为研究miRNA-125b在致细胞病变牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染牛肾细胞(MDBK细胞)过程中诱导细胞凋亡的机制,本研究将cpBVDV感染MDBK细胞,并将构建的pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞作为阳性对照.采用荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测细胞中miRNA-125b和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2) mRNA转录水平,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率.检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞中miRNA-125b的转录水平分别为正常细胞对照组的2.01倍和3.85倍,Bcl-2 mRNA的转录水平分别为对照组的0.71倍和0.31倍;pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞48 h后,Bcl-2 mRNA的转录水平为正常细胞对照组的0.42倍.细胞凋亡检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞的凋亡率分别为15.06％和36.43％;pcDNA3.1-miR-125b转染48 h,细胞的凋亡率为25.56％.结果表明miRNA-125b在cpBVDV感染MDBK细胞过程中能够通过抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平从而诱导细胞产生凋亡.     

miR-125a/125b基因家族进化分析及其在猪睾丸组织中的表达变化

采用生物学信息方法在miRBase中搜索动物miR-125a/125b基因家族序列,利用Ensembl数据库信息确定miR-125a/125b在基因组中的位置,采用MEGA 5.0构建miR-125a/125b家族的系统进化树,并利用qRT-PCR检测miR-125a和miR-125b在沙子岭猪睾丸组织不同发育时期(D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)的表达变化。结果在miRBase数据库检索29个物种共58条miR-125家族序列,分布广泛,且有高度的保守性,除一个位于内含子区,两个位于外显子区,其余miR-125a/125b位于基因间隔区,在进化过程中,同种物种的进化方向具有高度的一致性,进化速度也有所不同。qRT-PCR检测结果显示,miR-125a/125b在沙子岭猪睾丸组织中不同发育时期的具有相同的趋势,即出生后其表达水平缓慢升高,保育期开始降低,性成熟期又开始呈现升高趋势,随着体成熟表达量开始降低。本研究结果为进一步探明miR-125a/125b基因家族在猪睾丸组织中的功能及作用机制奠定基础。     

牛miR-29b影响牛病毒性腹泻病毒感染BALB/c小鼠的作用

前期研究发现高表达miR-29b能显著抑制牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)在体外的复制,而miR-29b过表达是否影响BVDV在体内的复制尚未见有报道。研究设计扩增牛pre-miR-29b基因片段的引物,以MDBK基因组为模板,PCR扩增pre-miR-29b并克隆至慢病毒载体pLL3.7。将阳性质粒pLL3.7-pre-miR-29b与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度,同时包装pLL3.7空质粒的慢病毒作为阴性对照。将4～5周龄BALB/c小鼠随机分成5组,每组6只,连续2次尾静脉注射2.5×10~7 IU慢病毒悬液pLL3.7-pre-miR-29b或pLL3.7,并于慢病毒注射后96 h通过滴鼻途径攻毒BVDV毒株NADL(1.68×10~5 TICD_(50)/只),于攻毒后不同时间(0,2,4,10,15 d)处死BALB/c小鼠,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和血液,提取总RNA,使用荧光定量RT-PCR检测不同组织中BVDV拷贝数;同时制备病理组织切片观察各组织病变情况。结果显示,成功构建pLL3.7-pre-miR-29b质粒;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b和pLL3.7慢病毒;使用荧光定量RT-PCR检测发现,pLL3.7-pre-miR-29b感染能显著性降低BVDV拷贝数;与pLL3.7-pre-miR-29b感染的处理组相比较,pLL3.7感染的对照组中各组织病变情况较为严重。结果表明,BALB/c小鼠体内过表达miR-29b能明显抑制BVDV的复制,减轻BVDV感染造成的病变,为以后研发抗BVDV的有效策略和方法提供了理论依据。     

Glucose participates in the formation of goose fatty liver by regulating the expression of miRNA-33/CROT

Glucose oversupply promotes formation of fatty liver, and fatty liver is usually accompanied with hyperglycemia. However, the mechanism by which glucose promotes formation of fatty liver is not very clear. In this study, fatty liver was successfully induced in Landes goose by 19 days of overfeeding with corn-based feed, the overfed geese had a significantly higher level of blood glucose than the normally fed geese (control group). In goose primary liver cells, high level of glucose promoted fat deposition and induced the expression of SREBF2(or SREBP2), a key regulator of lipid metabolism, and its intronic gene, miR-33. Moreover, overexpression of miRNA-33(miR-33) promotes lipid accumulation in goose primary liver cells. Consistently, miR-33 inhibitor suppressed glucose induced lipid accumulation in liver cells. Interestingly, the relative abundance of miR-33 in goose fatty liver was significantly higher than that in normal liver, while the relative mRNA and protein abundances of CROT, the target gene of miR-33, in goose fatty liver were significantly lower than those in goose normal liver. Taken together, these findings suggest that miR-33 mediates glucose promotion of lipid accumulation in goose primary liver cells, and that glucose participates in formation of goose fatty liver by regulating the expression of miR-33/CROT.