巴东木莲DNA的提取及SRAP-PCR反应体系的正交优化止父优化

研究确定了提取巴东木莲基因组DNA的方法．采用正交试验设计法对影响SRAP—PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量、Mg^2＋和dNTPs浓度及PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了比较、优化,同时对DNA模板浓度进行了筛选。结果表明,Mg^2＋、dNTPs、砌酶及引物的不同水平均对PCR反应结果有显著的影响。建立了巴东木莲20μL SRAP—PCR的反应体系为1xbuffer、Mg^2＋浓度为2．0mmol·L^-1、dNTPs浓度为0．25mmol·L^-1、引物浓度为0．45μmol·L^-2、Toq酶为O．5U和模板DNA40ng。适宜的扩增程序为94℃预变性1min,94℃变性1rain,33℃复性1min,72℃延伸1min,10个循环;94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72℃延伸5min。试验表明,该体系重复性好、稳定性强．     

枫香树DNA提取及SRAP-PCR反应体系的建立与优化

通过不同处理的枫香树叶片及基因组DNA提取方法的对比,并采用L16(45)正交试验设计,对影响SRAP-PCR反应体系的Mg2+,d NTPs,引物浓度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行优化,确立枫香树SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明,改良CTAB法提取枫香树基因组DNA的产率和纯度均可满足下游试验需要。SRAP-PCR最优反应体系为:总体积20μL,含1×PCR Buffer,1.5 mmol·L-1Mg2+,0.16mmol·L-1d NTPs,0.5μmol·L-1引物,0.9 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。各因素对反应结果的影响大小顺序为Taq DNA聚合酶量d NTPs浓度Mg2+浓度模板DNA用量引物浓度。运用优化的SRAPPCR反应体系对10个不同居群的枫香树基因组DNA扩增检测,结果均能获得稳定性高、多态性丰富和重复性好的条带图谱。     

濒危植物巴东木莲ISSR分子标记技术体系的建立

利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的ISSR-PCR分子标记技术体系.对影响ISSR-PCR反应的多个因素,包括引物和DNA模板浓度、Taq酶用量、Mg2 和dNTPs浓度以及PCR扩增的退火温度、退火时间及循环次数等进行了优化.结果表明,适于巴东木莲ISSR-PCR反应的分子标记技术体系为:反应总体积20μ1,含2μ1 10×buffer、1μ1 20 mmol/L Mgcl2、4μ1 2 pxaoL/L引物、0.4μ1 10 mmoL/L dNTPs、0.8μ1 5 u/μ1Taq酶及40 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94 oC变性30 8,54 oC复性45 s,72℃延伸1.5min,35个循环,最后72℃延伸7 min.本研究建立的ISSR分子标记技术体系稳定性强,重复性高.     

巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取与双向电泳分离

优化巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取方法,并用双向电泳方法分离提取蛋白,得到分辨率高和重复性较好的双向电泳图谱.在考马斯亮蓝R-250染色胶上,开花前柱头蛋白有858个蛋白点,开花后的聚合雌蕊柱头有865个蛋白点.有1个蛋白点只在开花前柱头蛋白中表达,3个蛋白点只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达.为分析花粉和柱头间的识别奠定基础.     

树莓基因组DNA的提取及ISSR反应体系的正交优化

以树莓优良野生种质插田泡(Rubus coreanus)为材料,比较了SDS法、CTAB法和改良CTAB法提取树莓基因组DNA的效果,结果发现三种方法均能提取到树莓DNA,但改良CTAB法优于CTAB法和SDS法,其所得的DNA质量最好,杂质最少.通过正交试验设计,对Taq酶,primer,dNTP和DNA用量进行了筛选,建立了树莓ISSR技术最优反应体系,即25μl反应体系中含有1 ×PCR Buffer,2 mmol/LMg2+,1.5 U Taq酶,0.2 μmol/L primer,0.4 mmol/L dNTP和20 ng DNA.采用引物UBC835和UBC873分别对10个树莓品种和8个树莓野生资源进行检验发现,该体系工作效果良好.     

羊角槭基因组DNA提取及SRAP-PCR体系优化

采用CTAB法、SDS法、偏重亚硫酸钠法提取槭属中羊角槭基因组DNA,通过DNA含量测定、琼脂糖凝胶电泳检测对所提DNA质量进行分析.结果表明, 3种提取方法中CTAB法最适合提取羊角槭基因组DNA,所得DNA的质量和纯度较高.以CTAB法提取的DNA为模板进行SRAP扩增反应,对SRAP反应体系的dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度3个主要影响因子进行筛选.获得羊角槭SRAP最优反应体系为:50 μl的PCR体系中含有DNA模板100 ng、10×PCR Buffer (不含Mg2+)、Mg2+ 2.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶 1.0 U.     

用正交设计法优化臭椿SRAP-PCR反应体系

[目的]确定臭椿SRAP-PCR反应条件,为进一步研究臭椿SRAP分子标记提供依据。[方法]以新疆吐鲁番3号和江西臭椿叶片DNA为材料,利用引物组合EM1-EM8进行SRAP-PCR反应的L16(45)正交试验,建立了臭椿SRAP-PCR反应体系,新复极差法对体系进行方差分析,并对体系的稳定性进行检测。[结果]确定臭椿SRAP-PCR反应体系为:模板DNA 2.5 ng/μl、Mg2+1.75 mmol/μl、dNTPs0.3 mmol/μl、Taq酶0.3 U/μl、引物0.6μmol/μl、10×PCR Buffer 2.5μl;该体系稳定,适用于臭椿的SRAP反应。[结论]该试验优化的SRAP反应体系,将为臭椿种质资源多样性评价、分子标记,以及遗传连锁图谱构建奠定基础。     

正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以辣椒基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP反应体系中的5种关键因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行优化,结果表明,辣椒SRAP-PCR最佳反应体系为:Taq DNA 聚合酶0.75 U、Mg2+ 0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8 μmol/L、模板DNA 50 ng,总体积为10 μL.运用该体系对辣椒3份种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从198个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的35个引物组合.该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒分子遗传学中的应用提供科学依据.     

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系.结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10 μL,包含2.0 mmol ·L-1Mg2+、300 μmol·L-1dNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶、4μmol·L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer.各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA.用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性.     

槟榔基因组DNA提取及ISSR反应体系的优化

以槟榔为试验材料,用改良的CTAB法提取基因组DNA,并设置不同梯度分别对每个PCR反应因子做了相应的试验.结果表明:改良的CTAB法提取的槟榔基因组纯度高、质量好;同时,建立了适合槟榔ISSR-PCR反应体系,即20μL PCR反应体积中,模板DNA浓度为30 ng/μL,浓度为2.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物为浓度为0.8μmol/L.     

新疆哈密瓜SRAP反应体系建立和优化

[目的]研究新疆哈密瓜SRAP反应的最佳体系,为进一步研究新疆哈密瓜分子标记辅助育种提供基础.[方法]采用均匀实验设计法对新疆哈密瓜SRAP - PCR反应体系的5个主要因子进行优化.[结果]优化后的SRAP - PCR反应体系扩增多态性高、带型清晰、稳定性好,是新疆哈密瓜SRAP扩增的最佳条件.利用该优化体系,对12个新疆哈密瓜地方品种基因组DNA进行SRAP扩增,大部分材料扩增出来的带清晰可辨、条带丰富、背景无干扰,满足分子标记应用的要求.[结论]20 μL的反应体系中各成分用量或浓度为:模板DNA 36 ng、Taq DNA聚合酶2.5U、dNTPs2.2 5 mmol/L、引物0.6μmol/L、Mg2+ 1.75 mmol/L和2μL10×PCR buffer.     

Optimization of SRAP-PCR Reaction System in Flax

Part of wild flax species and cultivated species were used as materials for optimizing SRAP-PCR reaction system, and concentration gradient test was made for all factors in order to select and establish the optimal program and system fitting for amplifying high diversity, good reproducible and clear bands. This program and system could well meet the requirement of flax SRAP and prove that SRAP marker was feasible for researching genetic polymorphism of flax.     

利用正交设计优化亚麻SRAP-PCR反应体系

为亚麻分子标记及分子育种提供可靠的理论依据,利用正交试验设计对亚麻SRAP-PCR反应体系中的4因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度)在3个水平上进行正交优化,确立了适合亚麻SRAP-PCR反应的20μL体系:75ng模板DNA、0.75μmol.L-1引物、1.5mmol.L-1 Mg2+、0.40mmol.L-1dNTPs和1.5UTaqDNA聚合酶。     

正交设计优化唇形科植物ITS反应体系

采用改良的CTAB法提取16种唇形科植物总DNA,利用正交设计L9(34)探讨Mg2、dNTP、引物及Taq DNA聚合酶4因素对益母草ITS-PCR反应的影响.正交试验结果采用方差分析与直观分析相结合,建立唇形科植物益母草的ITS-PCR反应体系(25 μL):2.5 μL 10×Buffer,1.5 UTaq聚合酶,2.0 mM Mg2+,0.15 mM dNTP,0.4 μM引物;最适退火温度为53.6℃.应用该优化体系,对16种唇形科植物进行ITS-PCR.验证表明,优化后的反应体系具有较高的稳定性,可用于唇形科植物的ITS扩增.     

利用正交设计优化向日葵ISSR-PCR反应体系

向日葵产业的发展对调整黑龙江省种植业结构、利用中低产田、增加农民收入具有十分重要的作用,为了推广ISSR分子标记技术在向日葵分子育种上的应用,利用正交设计对向日葵ISSR-PCR反应体系中的5个因素(模板DNA、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量)在4个水平上进行优化,确立了适合向日葵ISSR-PCR反应的20μL体系:50ng模板DNA、2.0μmol·L-1dNTP、37.5μmol·L-1 Mg2+、8μmol·L-1引物、8UDNA Taq酶。     

诺丽叶片DNA的提取及ISSR-PCR 反应体系的建立

[目的]提取诺丽（Morinda citrifoliaLinn.）叶片DNA,并建立ISSR-PCR反应体系。[方法]以3份采自海南、4份采自美国的诺丽种质的叶片为材料,对其DNA提取和ISSR分子标记方法进行了研究。[结果]采用改进的CTAB DNA微量提取法,可以得到高质量的诺丽叶片基因组DNA。用14条不同的ISSR引物对所提取的诺丽基因组DNA进行了ISSR分子标记分析,其中7条引物在诺丽DNA中可扩增出多态性产物。[结论]建立了诺丽叶片基因组DNA快速、高效的提取方法和ISSR标记体系,可为ISSR分析应用于诺丽遗传研究奠定良好的基础。     

洋葱(Allium cepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2 、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2 、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。     

红花基因组DNA的提取及RAPD体系的优化

用多种方法提取红花老叶及嫩叶DNA,进行比较,最后确定老叶DNA的提取用高盐低pH法,嫩叶用Michael等的方法.设计两次正交实验来确定红花RAPD体系中各成分的浓度,最终确定了一个既稳定又能扩增出最多条带的适合红花的RAPD最优体系,即25 μL反应液中,dNTP 200 μM, Mg2+1.5 mM,引物0.8 μM,Taq酶1U,模板30～60 ng.     

春兰基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

以春兰为研究材料,对春兰基因组DNA的提取以及RAPD-PCR反应体系进行了优化。结果表明,在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇去除酚类物质,采用高盐沉淀DNA和多次洗涤去除糖类,可以得到高质量春兰基因组DNA。电泳检测表明,所获得的DNA完整,无降解,完全可以满足R-APD等分子标记分析的需要。同时对春兰RAPD-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化,建立了适合春兰R-APD分子标记的最佳反应体系,即20μl反应体系中含1UTaqDNA聚合酶,60μmol／L dNTPs,2．25mmol／L Mg^2＋,1．0μmol／L引物,1．5ng／μl模板DNA。