稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立

根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。     

甲型H1N1流感病毒HA蛋白的截短表达、纯化及鉴定

构建pET表达载体,通过原核表达系统制备甲型H1N1流感病毒HA的截短表达蛋白,获得纯化蛋白,并分析HA蛋白的反应原性.人工合成A/California/04/2009 H1N1流感病毒HA基因,以其为模板,PCR扩增HA的一部分基因,去除HA蛋白信号肽、跨膜区、胞内区的基因序列,仅扩增HA1和HA2的基因.将扩增的基...     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

H3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析

为了研究H3亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的粪便样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H3亚型流感病毒,命名为A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与韩国水鸟的H3N2亚型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高,达到94.6％.系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟.本研究为H3亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

湖北株H3N8亚型马流感病毒HA基因的序列测定及其HA蛋白遗传特性分析

2008年从湖北省分离到1株H3N8亚型马流感病毒A/equine/Hubei/6/08。以2002年美国KENTUKY株为模板设计HA基因测序引物,进行RT-PCR,然后测定该分离株的HA基因核苷酸序列。经NCBI上Blast同源性比较发现,与A/equine/Newmarket/5/2003(H3N8)同源性较高为98.7%。HA蛋白遗传进化分析表明该毒株隶属于H3N8亚型马流感病毒中的美洲系福罗里达亚系。该株与OIE现在推荐的疫苗候选株A/equine/Kentuck-y/5/2002(H3N8)HA1蛋白氨基酸序列比对发现有3处氨基酸替换位点;与OIE以往推荐的疫苗候选株A/e-quine/Kentucky/1/1994(H3N8)比对发现有11处氨基酸替换位点。研究结果表明该分离株可作为中国研制马流感疫苗的候选株。     

稳定表达小反刍兽疫病毒衣壳蛋白的Vero细胞系的筛选和鉴定

本研究利用PCR方法扩增小反刍兽疫病毒(PPRV)的衣壳蛋白(N蛋白)基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-pN。利用电转的方法将该重组质粒转入非洲绿猴肾(Vero)细胞,并使用抗生素G418进行筛选。Western blot试验结果表明,N基因在Vero细胞中得到了表达,且能够随着细胞的传代稳定遗传。PPRV N基因的成功表达为小反刍兽疫的诊断、鉴定以及新型基因重组疫苗的开发奠定了基础。     

Annexin A2基因敲除MDCK细胞系的构建

应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除MDCK细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在MDCK细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至MDCK细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除Annexin A2蛋白的MDCK细胞株,并通过测序和Western blot验证敲除效果。通过细胞毒性试验验证MDCK细胞膜表面的Annexin A2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。测序结果和Western blot结果表明,通过Crispr/Cas9技术成功敲除了MDCK细胞的Annexin A2基因,但细胞毒性试验结果表明,敲除Annexin A2基因并不能减弱ε毒素对MDCK细胞的毒性。结果表明,Annexin A2蛋白不是ε毒素在MDCK细胞表面的受体,研究结果为今后MDCK细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的Annexin A2基因敲除的MDCK细胞也为Annexin A2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。     

禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。     

流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因,将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点,筛选到阳性重组子 ｐＵＣＨ５。然后将 ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移载体 ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ,筛选到重组转移载体ｐＢａｃＨ５。经过序列分析证明阅读框架正确后,在脂质体转染试剂介导下,ｐＢａｃＨ５与线性化的杆状病毒 ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化,获得纯化的重组杆状病毒ｒＢａｃＨ５。提取重组杆状病毒ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验结果表明 ＨＡ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的ＨＡ蛋白能够凝集公鸡红细胞,血凝价１２８０－２５６０ＨＡＵ／ｍｌ。ＨＡ蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达,为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。     

转Lp-PLA_2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。     

稳定转染pGM-CSF基因的哺乳动物细胞系的建立

构建稳定表达猪pGM-CSF基因的细胞系可以为工业化生产猪pGM-CSF并将其应用于新型兽药的开发提供生产细胞源。本试验用脂质体介导法将真核表达载体plRES2-EGFP-pGM-CSF瞬时转染BHK-21细胞,通过不同浓度的G418加压筛选和进一步采用单个克隆法筛选,建立稳定转染且高效表达pGM-CSF的BHK-21细胞株9个,采用Elisa方法测定稳定转染pGM-CSF的BHK-21细胞株细胞培养上清液中pGM-CSF的表达水平达到329.37±13.76ng/mL。为下一步从细胞培养物中大量提取目的蛋白并最终开发出一种用于提高动物疫苗免疫效力的新型生物制剂奠定基础。     

转Lp-PLA2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

不同亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的生长特性

禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类传染病。高致病力禽流感（HPAI）可引起禽类100％死亡，在世界范围内多次暴发，2004年年初HPAI再次在包括我国在内的一些亚洲国家暴发流行，但得到了很好的控制，7月份在泰国和我国的安徽省HPAI又有发生；低致病力禽流感（LPAI）一般不致鸡只死亡，但可以导致鸡产蛋量下降，同样制约着养禽业的发展，所以研究快速有效的诊断方法已刻不容缓。而且许多学者对MDCK细胞用于制作人流感疫苗作了大量研究。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

Establishment and characterization of canine rhabdomyosarcoma cell line CMS-C

A novel canine tumor cell line designated as the CMS-C cell line was established from pleomorphic rhabdomyosarcoma (RMS) raised in the prostate gland of a 14-year-old intact male mixed-breed dog. CMS-C cells displayed the same immunohistochemical characteristics (positive for vimentin and desmin and negative for cytokeratin and smooth muscle actin) as the original tumor cells and express myoD1 and UCP3, known as striated muscle-specific molecules, as shown by RT-PCR assay. Therefore, the established CMS-C cell line appears to be of rhabdomyoblast cell origin. The CMS-C cell line established from pleomorphic RMS will be a useful tool for further studies about canine RMS.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。