杆状病毒miRNA研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的非编码单链小RNA分子,在转录后水平调控靶基因的表达。MiRNA在生物发育、病毒感染、细胞周期、宿主免疫及代谢等多种生命活动过程中有着重要的调控作用。杆状病毒miRNA的研究起步较晚,近10a来的研究表明,杆状病毒miRNA在促进病毒感染方面具有重要作用。本文从杆状病毒miRNA的鉴定、生物合成途径、生物学功能和持续性感染等方面进行了概述,并对杆状病毒miRNA的研究前景进行了展望。     

基因工程微生物农药——昆虫杆状病毒

昆虫杆状病毒也是一类重要的、较早应用的昆虫病原微生物。昆虫感染病毒很常见，杆状病毒科的宿主范围限定在一小部分节肢动物昆虫、一些甲壳类和螨类，然而，敏感昆虫包括许多害虫。杆状病毒占所有已知感染昆虫病毒的60％以上，它们对脊椎动物和植物不具致病性。目前至少已有600多种昆虫（主要是鳞翅目昆虫）和其它无脊椎动物中发现杆状病毒感染，并常常在引起昆虫流行病，也是调节昆虫种群密度的重要病原因子。     

昆虫杆状病毒分子生物学及其应用研究的新进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒,具有重要的应用价值。首先,杆状病毒是昆虫杆状病毒表达系统的核心部分,该系统已在药物研发、疫苗生产等方面得到广泛应用。随着杆状病毒载体的不断改进,杆状病毒表达系统获得重组病毒的几率已从最初的0.1%~1%提高到现在的80%~90%,并且出现了一些新的宿主域扩大的杆状病毒载体。其次,杆状病毒是非复制型载体,且能高效表达目的蛋白,目前杆状病毒作为基因转移载体在基因治疗中已显示出良好的应用前景。此外,杆状病毒还是一类重要的微生物杀虫剂。重组杆状病毒杀虫剂及其安全性也是目前人们关注的焦点。综述了杆状病毒分子生物学及其最新应用进展。     

昆虫杆状病毒及其应用研究进展

杆状病毒是一类具有双链、环状DNA的病毒，因其在生物防治方面具有宿主专一性强、对人畜无害、对环境安全和可自然传播等特点，而得到人们广泛的关注。本文概述了昆虫杆状病毒特征和作为表达系统的应用。野生型昆虫杆状病毒具有杀虫速度慢、稳定性差和宿主域窄等缺点，因此本文还介绍了通过基因工程改造野生型昆虫杆状病毒，以提高其作用效率和扩大杀虫谱的方法，同时对杆状病毒的应用前景做出了展望。     

昆虫杆状病毒杀虫剂研究与应用综述

综述了对野生型昆虫杆状病毒和重组昆虫杆状病毒杀虫剂的研究进展,以及我国昆虫杆状病毒杀虫剂的应用研究现状。     

H9N2型禽流感病毒HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。     

携带绿色荧光蛋白的重组昆虫杆状病毒的构建

将GFP cDNA片段克隆到昆虫杆状病毒的转移质粒pBacPAK8上,构建成携带绿色荧光蛋白的表达载体pBacPAK8-GFP;采用脂质体共转染法,将载体pBacPAK8-GFP DNA和亲本病毒Ac-BacPAK6 DNA共转染Sf21细胞,荧光均匀地分布于整个细胞.病毒经空斑分离法,成功分离病毒克隆,获得了重组绿色荧光蛋白的杆状病毒.     

基孔肯雅病毒样颗粒的制备

为制备高纯度、均一的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒,将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因序列(C-E3-E2-6K-E1)人工合成后克隆至杆状病毒-昆虫细胞表达载体中;重组质粒转化DH1OBac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆状病毒杆粒;重组杆状病毒杆粒转染ExpiSf9昆虫细胞,包装获得重组杆状病毒,并再次感染Ex...     

昆虫杆状病毒杀虫剂的研究与应用进展

昆虫杆状病毒由于寄主专一性强、与环境相容性好等特点而受到人们广泛关注,成为生物防治害虫的重要内容之一。本文介绍了野生型昆虫杆状病毒的筛选和开发,高效、安全的基因工程重组杆状病毒杀虫剂的研究与应用,并对重组病毒的安全性进行了客观的分析和评价,对病毒杀虫剂的发展前景进行了展望。     

能产生多角体的可线性化杆状病毒的构建

【目的】改进用于同源重组研究的制备杆状病毒DNA的方法。【方法】采用PCR方法从BmNPV中扩增出多角体基因,并在其两端引入Bsu36 I酶切位点。将此片段克隆入转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞,获得重组病毒。该病毒能形成多角体,便于纯化,同时可以被 Bsu36 I酶切。该重组病毒的多角体纯化后被裂解,并提取病毒DNA。病毒DNA经Bsu36 I酶切后,与含gfp基因的转移质粒共转染家蚕BmN细胞,在荧光显微镜下观察重组病毒的转染效率。【结果】BmNPV多角体基因克隆入转移载体pBacPAK8中后,与线性化的AcPak6及BmPak6 DNA共转染sf细胞及BmN细胞,均能产生大量的多角体。获得的重组病毒DNA经酶切后,进一步与含gfp基因的转移质粒共转染的实验表明,这种改造后的重组病毒仍具有较高的转染重组率。【结论】本实验成功地对用于同源重组的杆状病毒DNA进行了改进,简化了病毒DNA的纯化方法,并且重组效率较高。     

杆状病毒表达系统的应用及展望

昆虫杆状病毒表达载体系统(BEV S)是当今基因工程领域4大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。BEV S具有安全性高,对外源基因克隆容量大,重组病毒易于筛选,具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点。由于其独特的优越性,BEV S成为细胞内研究诸如N a -K -ATP酶异源二聚体的首选系统,此系统得到广泛应用的同时,仍存在一些不足,有待继续改进。本文对BEV S的应用状况、存在的主要问题及其应用前景作一综述。1杆状病毒—昆虫表达系统的组成杆状病毒是一类超大双链环状DNA分子(约135 …     

昆虫杆状病毒组学研究进展

杆状病毒(baculoviruses)是一类专性感染无脊椎动物的共价闭合双链环状DNA昆虫病毒。由于杆状病毒对环境和人畜无害,其作为生物农药在生物防治方面发挥着重大作用。此外,杆状病毒还可作为一种真核表达载体,广泛用于药物研发、疫苗生产,以及作为基因转移载体用于基因治疗等方面。综述了杆状病毒的基因组学及蛋白质组学研究进展,对阐明病毒的感染机制具有重要意义,并且在此基础上可针对性地对其进行分子改良或开发高效的生物增效剂。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测

首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达

利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。     

HearNPV侵染对棉铃虫中肠碱性磷酸酶活性及表达水平的影响

【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下降,该过程可能协助病毒粒子侵染宿主。病毒对ALP活性的抑制作用机理之一是下调了ALP编码基因的表达水平。     

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

昆虫组织培养研究进展

昆虫组织培养目前已在生物学领域成为重要的研究工具.特别是成功的筛选出对杆状病毒敏感的细胞系及空斑技术的应用,使病毒的基础研究达到分子水平,如病毒的遗传改良、DNA的复制、蛋白质的合成及病毒的物理图谱等.近年来,人们已成功地利用昆虫组织培养进行病毒杀虫剂的大量生产,用于害虫生物防治,更显示出昆虫组织培养的重要意义.为此,本文对昆虫组织培养的研究进展作简单阐述.     

昆虫杆状病毒表达系统的研究及其新进展

就昆虫杆状病毒转移载体的优化、细胞株的优化、病毒滴度测定方法的改进及其将在未来农业、分子生物学、医学等领域得到广泛应用等方面进行了综述。