香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性,在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系中获得NPR1E基因,命名为MaNPR1E(GenBank登录号分别为：KF582550)。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA,包含一个1 755 bp的最大开放阅读框,编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域,属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明,MaNPR1E与海枣PdNPR3(XP_008808341.1)和油棕EgNPR3(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明,接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制,而在抗病品种中被激活;MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明,MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。     

芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建

为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄，进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种——雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA，并以其为模板，经PCR扩增芪合酶基因，各获得一长约1．6Kb的片段，将这2个片段分别连接到pGEM-Teasy和pUCm-T上进行测序，1个片段长为l622bp(命名为S1)，另一个片段长为l617bp(命名为S2)。然后将Sl正向插入pEV2的果实特异性启动子TFP2和NOS终止子，构建了植物表达载体pEV2S1；将S2正向插入植物表达载体pBll2l的35S启动子和NOS终止子之间。构建了植物表达载体pBS2．将重组体pEV2S1和pBS2转化大肠杆菌E．coli XLl，并对重组体进行了筛选和鉴定．     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

Mineirao柱花草MSRA基因的克隆及其植物表达载体的构建

根据抗病柱花草中的1个AFLP特异片段SG2950-1设计引物,利用RACE技术从Mineirao柱花草中克隆到一个MSRA基因:经测序比对,该序列与细胞色素氧化酶系基因有较高的相似性.构建了植物表达载体,通过冻融法将该载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,为进行该基因的功能分析奠定了基础.     

HARDY基因的克隆、原核表达及其植物表达载体的构建

为了给转HARDY(HRD)基因小麦研究奠定基础,利用PCR技术从拟南芥中克隆HRD基因,进行生物信息学分析,预测其编码的蛋白质结构与功能,构建原核表达载体pET28a(+)-HRD,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白的表达,同时构建pBin-HRD植物表达载体。测序分析结果表明,克隆的HRD与NCBI发布的拟南芥核苷酸序列的同源性为99%,其开放阅读框长555bp,可编码184个氨基酸,具有许多重要功能位点;成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HRD和植物表达载体pBin-HRD,诱导表达出大小约为23.3kD的蛋白,与理论值相近。     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建

利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。     

PSAG12序列克隆及PSAG12-ipt嵌合基因植物表达载体的构建

通过聚合酶链式反应技术，成功克隆了拟南芥SAG12基因5′端2130bp的非编码序列PSAG12。结构分析结果表明，该序列由55bp的5′－UTR和－1－－2075的5′端非转录序列构成，－1－－1345为拟贰芥SAG12基因启动子功能区，具有－1181－－1345增强子序列和衰老特异表达关键序列－571－－603，但无典型的TATA box、CATT box和转录起始位点帽子结构序列，成功构建了PSAG12－ipt嵌合基因植物表达载体pAGT，为通过基因转移技术人为控制植物叶片细胞分裂素含量，延迟叶片衰老打下了基础。     

异戊烯基转移酶基因(ipt基因)的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

从Agrobacteriumtumefaciens(strainAKE10)中分离其质粒并以质粒DNA为模板进行多聚酶链式反应,特异扩增出一条长约720bp的DNA片段,经克隆及序列测定表明,为根癌农杆菌AKE10质粒异戊烯基转移酶基因的完整编码序列,与Genebank中公布的核苷酸序列具有100%的同源性。与A.tumefaciensPO22、Tm-4、BO542菌株和A.vitisCG474、Tm4菌株质粒中异戊烯基转移酶基因进行序列比较,同源性分别为90%、89%、86%、89%和89%;推导氨基酸序列的同源性分别为90.42%、88.23%、90.10%、89.58%和89.12%。成功构建了异戊烯基转移酶基因植物表达载体pBT,为探索植物细胞分裂素生物合成的分子机制、作用机理及激素互作等研究打下了基础。      

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。     

橡胶树羟基腈水解酶基因的克隆、表达和基因家族分析

植物体内羟基腈水解酶(HNL)催化羟基腈类化合物水解,释放氢氰酸,抵御害虫和病原菌的侵害。橡胶树是产氰植物,生物信息学研究表明,橡胶树有6个HNL基因,在分子进化分析中与大戟科其他植物的HNL基因聚为一类,与十字花科等植物的HNL亲缘关系较远,说明大戟科HNL基因的重复发生在与十字花科等植物分化之后,大戟科植物通过HNL基因的重复强化对病虫害的防御作用。通过RT-PCR从橡胶树热研7-33-97品系中克隆了其中最重要的1个HNL蛋白编码基因Hb HNL-1。该基因c DNA序列全长1 003 bp,阅读框771 bp,编码257个氨基酸,其编码蛋白分子量为29.2 ku,理论等电点为5.7。定量PCR分析表明,Hb HNL-1在初生胶乳中的表达量是次生胶乳中的100多倍,在幼嫩叶片中的表达量为成熟叶片的8倍。说明橡胶树的幼嫩组织器官是Hb HNL-1的重点防御部位。     

番茄XRN2基因的克隆、表达分析及遗传转化

为了研究番茄XRN2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄各组织混合cDNA中扩增了番茄XRN2基因全长编码序列,并对其进行了表达模式分析。结果表明该基因在番茄根部表达最强烈。通过对番茄叶片进行伤害诱导处理,发现番茄XRN2基因表达呈上升趋势。将该基因在组成型启动子CaMV35S驱动下定向构建至植物表达载体pCambia1301-35S,重组载体命名为pCambia1301-35S-XRN2和pCambia1301-35S-AsXRN2。通过农杆菌介导法转化获得转基因番茄,为进一步阐明XRN2基因在番茄中的功能奠定了基础。     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。