萼脊兰TUB基因片段的克隆及序列分析

为了给筛选萼脊兰内参基因和研究TUB基因的生理功能提供研究基础,对萼脊兰TUB基因片段进行克隆与序列分析。采用CTAB法提取萼脊兰盛花期花瓣总RNA,并运用RT-PCR方法克隆萼脊兰TUB基因序列,长度为1 055 bp,编码351个氨基酸残基,氨基酸序列中存在微管蛋白的保守区域GGGTGSG。序列分析结果表明:与其他已登录物种的TUB基因相比,其核苷酸序列的同源性达75%~96%,与朵丽蝶兰(JN185665.1)同源性高达96%,氨基酸序列的同源性也在96%以上,且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性。在Gen Bank注册,登录号为KP686397。     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

苹果属无融合生殖SERKs基因家族的克隆和表达分析

本研究利用同源克隆法以苹果属平邑甜茶和杂种后代叶片为试验材料,克隆得到4个SERK基因家族片段,并分析了SERKs家族基因在平邑甜茶和杂种后代不同器官和组织中的表达情况。研究结果表明:分离获得的4个SERK基因家族片段的氨基酸序列与模式植物拟南芥、烟草等植物的同源性均在84%以上,同时与其他物种的氨基酸序列进行Blast比对都具有较高的同源性;RT-PCR定量分析结果表明SERK1、SERK2、SERK3、SERK4基因主要在生殖器官中表达。因此,推测SERKs基因在平邑甜茶和杂种后代生殖发育过程中起着重要的调控作用。本研究结果为进一步揭示无融合生殖的发生机理奠定了基础。     

紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸支路的关键酶,它催化苯丙氨酸生成肉桂酸,完成该支路第一步反应。本实验利用同源克隆方法成功克隆了紫苏PAL基因cDNA片段,命名为PerPAL-1（GenBank登录号：HQ388347.1）,该片段长399 bp,编码133个氨基酸。通过氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与丹参和藿香PAL该片段的同源性分别高达96%和95%。PAL系统进化树表明PerPAL-1与唇形科植物的PAL亲缘关系最近。PerPAL-1基因在叶中表达最强,根中次之,而在茎中表达最弱。     

冬瓜抗病基因同源序列的克隆及分析

以已知植物抗病基因的保守区域为基础设计简并引物,从冬瓜抗病材料B227基因组中分离NBS-LRR类抗病基因同源序列,共获得32条特异序列,其中17条具有完整开放阅读框。这17条序列的核苷酸同源性变化范围为56.4%~99.8%,氨基酸的同源性变化范围为46.2%~100.0%。序列相似性分析结果表明,这些冬瓜抗病基因同源序列均包含P-loop,Kinase-2和GLPL等保守结构域。与已知抗病基因构建系统进化树,将这17个序列分为2个亚组,均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。本研究将为抗病基因全长序列克隆、功能分析及定位等研究提供帮助。     

全明星草莓乙烯受体Etr1基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙烯受体Etr1基因片段,为进一步研究Etr1基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础.以全明星草莓成熟果实中分离到得基因组DNA为模板,经PCR扩增到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pEGM-T easy vector上经测序分析,基因全长617 bp,编码205个氨基酸.序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr1的cDNA序列同源性98%,氨基酸序列同源性97%.     

“金手指”香蕉抗枯萎病基因同源序列的克隆与分析(英文)

本研究以抗镰刀菌枯萎病香蕉种质"金手指"(AAAB)为材料,根据已克降的抗枯萎病基因的NBS保守结构域设计简并引物,通过同源序列克隆获得了20条来自基因组DNA的RGA片段,大小为530 bp左右.根据其推断的氨基酸序列,经保守结构域分析,其结构域均为NB-ARC,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因类序列.它们均具有P-loop(GMGGVGKTT),Kinase-2(LLVLDDIW),RNBS-B(CKVLFTTRS)及疏水氨基酸结构域GLPL(GLPLALKVL)等4个保守氨基酸基元.20个RGA之间核苷酸序列的相似性在41.1%～99.3%之间,氨基酸序列的相似性在33.2%～96.3%之间.同时,对分离得到的20条RGAs进行系统发育树分析,发现它们分布在5个不同的区域.并且所编码的氨基酸序列与已知抗枯萎病基因Fom-2、I2C-1、I2C-2和I2等编码的氨基酸序列表现出28%～54%的同源性,证明了抗病基因在进化上具有一定的保守性.因此,这些抗病基因同源片段(RGA)的分离将为进一步从香蕉中分离抗枯萎病基因打下基础,也可作为分子标记筛选香焦抗枯萎病的候选基因.     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

棉花多抗品种中植棉KV-1抗病基因同源序列的克隆与分析

 许多抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复区（LRR）。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop（kinase-1a）、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%~60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%~60%。这些抗病基因同源序列（RGAs）可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。     

粘虫EF-1a和AK基因的克隆及real time RT-PCR方法建立

为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR Green Ⅰ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲线和标准曲线分析等建立实时RT-PCR方法。结果表明,从粘虫中克隆获得EF-1a和AK基因片段长度分别为622 bp和1020 bp,分别编码207个氨基酸和339个氨基酸;序列同源性分析结果表明,粘虫EF-1a与鳞翅目昆虫家蚕、桦尺蠖和柑桔凤蝶的EF-1a氨基酸序列同源性为95%以上;AK与鳞翅目昆虫草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的AK氨基酸序列同源性为98%以上。熔解曲线和标准曲线结果显示,设计的EF-1a和AK基因引物均可应用于实时RT-PCR扩增。     

粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因cDNA片段的分离及鉴定

为了研究二氢黄酮醇还原酶（DFR）在石榴花色形成中的作用,根据GenBank中登录的相关物种DFR基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法,从‘重瓣粉花’石榴花瓣总RNA中扩增出cDNA片段。测序结果表明,该cDNA片段长446 bp,编码148个氨基酸,序列分析表明,该片段与蓝灰石竹、水蓼、苦荞麦、荞麦、甜樱桃、金荞麦、菠菜、马六甲葡萄、山葡萄、马蹄纹天竺葵、仙客来等物种的氨基酸同源性在78%~81%以上,存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVQPVQRPVHDETSWSDLDFVWAT”,说明已成功克隆到‘重瓣粉花’石榴DFR基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为JN381544。     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因；【方法】肌肉组织提取总RNA，利用设计的引物进行RT-PCR，PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli DH5α，检测阳性克隆并测序；【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%，预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域；【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank (Accession.EF369511)。     

小麦硬度主效基因Pina和Pinb的克隆和序列分析

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状. 根据已报道的谷类作物中硬度主效基因Pina和Pinb的DNA序列, 设计了两对简并引物, 以我国软质小麦品种京411基因组DNA为模板, 进行PCR扩增, 分别获得了约450 bp的Pina和Pinb基因的全长特异性片段. 将其克隆到pGEM-3Zf(+)上, 重组子和酶切鉴定正确后, 进行序列测定和分析. 结果表明, 与     

紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段（GenBank登录号：JN032113.1）,该片段长为579 bp,共编码193个氨基酸残基,并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%,系统进化树分析表明PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表达,且叶中的表达量较高,内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明,脱落酸、水杨酸处理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。     

几种植物白藜芦醇合酶基因保守序列的克隆与分析

根据GenBank中登录的一些植物的白藜芦醇合酶基因(resveratrol synthase,RS)保守序列设计引物,采用PCR技术从葡萄科植物(蛇葡萄、三叶爬山虎、五叶爬山虎和云南爬山虎)、桑科植物(桑树)和豆科植物(花生)的幼嫩叶片中扩增出该基因的DNA片段。测序结果表明,片段长635 bp,6个片段均不含内含子,分别编码211个氨基酸,均包含白藜芦醇合酶基因的特异片段和芪合酶(stilbene synthase,STS)家族特异性信号序列。     

巴西橡胶树一个Mlo基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是植物抗病基因中的重要成员。巴西橡胶树Mlo基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病橡胶树新品种奠定基础。本研究以大麦Mlo基因(GenBank登录号: Z83834)为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,最后得到巴西橡胶树Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因CDS片段1668 bp,编码555个氨基酸,分子量为63.14 kDa,等电点是8.85。对巴西橡胶树Mlo的编码蛋白结构域进行分析发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含8次跨膜结构。通过对不同物种的Mlo同源蛋白进行聚类分析发现,巴西橡胶树Mlo蛋白与木薯Mlo蛋白同源性最高,达到92.1%,其次是蓖麻(87.6%);在拟南芥基因组中,与AtMlo8的相似性最高,达到67%,而且AtMlo8也包含有8次跨膜结构,因此,将巴西橡胶树中克隆的Mlo基因命名为HbMlo8。通过对所克隆的HbMlo8基因分析可知,该基因属于Mlo基因家族成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证巴西橡胶树HbMlo8的功能奠定了基础。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

狗头枣GSTU基因的克隆及其序列分析

为探索红枣GSTU类基因在红枣抗逆中的分子作用机制,本研究以狗头枣枣树叶片的DNA为模板,根据枣GSTU基因的序列(HM345954.1)设计引物,采用PCR方法获得GSTU基因序列,并利用生物信息学手段对其所对应蛋白的结构域、功能域、理化特性、跨膜区、二级结构及亚细胞定位等进行分析。结果表明:克隆到的DNA序列全长838 bp,具有2个外显子和1个内含子,内含子在292~460 bp碱基处,该序列与GenBank中枣的GSTU核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.85%和100%,表明成功的克隆了狗头枣的GSTU基因。该序列编码222个氨基酸,分子量为25.268 kD,理论等电点(pI)为6.10;亲水性的平均数为-0.242,表明该蛋白是亲水性蛋白。二级结构主要以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,不存在信号肽,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白,该蛋白可能位于内质网(膜)和质膜上。本研究获得的狗头枣GSTU基因在基因结构上含有1个内含子,在核酸序列及氨基酸序列上与GenBank中枣的GSTU基因同源性高,并对其理化性质、结构等进行了预测与分析,为进一步研究红枣抗逆分子机制提供理论基础,同时为红枣品种的选育提供理论支持。