新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析

【目的】分离并鉴定新疆羊种布鲁氏菌。原核表达该菌的L7/L12蛋白,检测该蛋白的反应原性及进行部分生物学分析。【方法】采用细菌划线培养、形态学观察、PCR检测以及生化试验进行布鲁氏菌分离鉴定。利用常规分子生物学方法表达并纯化羊种布鲁氏菌分离株的L7/L12蛋白,应用Western Blot分析融合蛋白的反应原性。使用生物信息学软件对该蛋白进行了生物信息学分析。【结果】分离鉴定确定该菌株为羊种布鲁氏菌。经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE试验显示纯化的L7/L12蛋白为单一条带;经过Western Blot检测,该融合蛋白具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。【结论】鉴定出该分离菌株,表达并纯化了该菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot证明该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。     

布鲁氏菌核糖体L7/L12蛋白的原核表达及对鼠源树突状细胞的作用

为了研究和探讨布鲁氏菌核糖体L7/L12蛋白对鼠源树突状细胞(BM-DCs)分化和成熟的影响,用布鲁氏菌S2疫苗株为模板扩增L7/L12基因,构建重组质粒pET30a-L7/L12,用大肠埃希菌原核表达系统进行诱导表达,并用Ni柱对表达的蛋白进行纯化.用IL-4和GM-CSF诱导培养鼠源DCs,用脂多糖(LPS)和L7...     

布氏杆菌L7/L12和OMP31基因克隆及融合表达

本研究根据已经发表的布氏杆菌基因序列,选择种间序列极为保守的保护性抗原L7/L12、OMP31基因,依此进行PCR扩增,利用引物上设计好的限制性内切酶酶切位点进行基因重组,构建了PME290-SDLOmp高效表达载体,并转化绿脓杆菌(PAK/2pfs),通过培养得到了表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果符合预期。本项研究为进一步开展布氏杆菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株OPM25和OPM31蛋白B细胞抗原表位分析

应用PCR技术对羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株的OMP25和OMP31基因进行扩增、克隆和测序。测序结果显示,NN1202和LA1105株的OMP25和OMP31基因在布鲁氏菌种间高度保守。应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域;应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析,OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202区域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183区域可能是优势B细胞抗原表位。     

布鲁氏菌外膜脂蛋白OMP10基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫原性研究

根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌OMP10序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增OMP10基因,将目的基因克隆入pEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a/OMP10,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白pET-32a/OMP10,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,并免疫小鼠。结果表明,成功构建了含OMP10的表达载体,经多次对表达条件的优化,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步动物免疫试验及研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

羊口疮病毒内脏和口唇感染株B2L和F1L基因的比较分析

【目的】分析内脏和口唇感染羊传染性脓疱病病毒主要致病因子F1L和B2L基因和蛋白的差异，为进一步研究该病毒的致病机制提供参考。【方法】对内脏和口唇感染株F1L和B2L基因进行PCR扩增后克隆测序，运用生物信息学软件对其序列及编码蛋白的二级结构、磷酸化位点和跨膜结构域进行预测和分析。【结果】内脏株和口唇株的F1L基因长度均为1 564 bp，分别编码342和343个氨基酸；B2L基因长度均为1 370 bp，均编码378个氨基酸。内脏和口唇感染株B2L基因核苷酸序列同源性为97.80%，氨基酸序列同源性为98.15%；两者的F1L基因核苷酸序列同源性为95.49%，氨基酸序列同源性为87.20%。氨基酸组成显示：内脏和口唇感染株B2L蛋白缬氨酸含量最高；口唇株F1L蛋白亮氨酸含量最高，内脏株F1L蛋白精氨酸含量最高。【结论】羊口疮病毒内脏和口唇感染株的B2L基因保守性良好，而F1L基因差异明显，本结果可为进一步研究羊口疮病毒致病机制提供参考。     

猴痘病毒E2L蛋白的表达、纯化及免疫原性评价

【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因,将其克隆至表达载体pET-28a（+）上构建原核表达载体pET-28a-E2L,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)受态细胞,采用控制变量的方法对融合蛋白最佳诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。融合蛋白经His-Bind柱亲和层析纯化后,经腹腔注射免疫昆明小鼠,从免疫当天（第0 d）开始每隔7 d通过断尾法采集昆明小鼠血清1次,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】以构建的原核表达载体pET-28a-E2L转化BL21(DE3)受态细胞后,经IPTG诱导,能成功表达获得融合蛋白E2L,且主要以包涵体的形式进行表达。融合蛋白E2L的最佳诱导表达条件为40℃下以1.0 mmol/L IPTG诱导16 h,通过His-Bind柱亲和层析纯化时的最佳咪唑洗脱浓度为100 mmol/L。昆明小鼠免疫试验结果表明,纯化...     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。     

烟碱转运候选基因NtABCG6L生物信息学及表达特征分析

为预测前期筛选到的可能影响烟草烟碱含量的NtABCG6L基因是否具有转运烟碱功能,本研究采用生物信息学方法对NtABCG6L基因的启动子序列以及编码蛋白的理化性质和结构进行分析,利用软件对烟碱与NtABCG6L蛋白进行分子对接,并分别在烟株打顶0、7、14、21 d取根、茎、叶测定烟碱含量和NtABCG6L基因的相对表达量,以分析NtABCG6L基因表达量与烟碱转运效率的关系。结果表明,NtABCG6L基因共编码729个氨基酸;NtABCG6L蛋白分子量为81.29 kDa,理论pI值为8.97,含有ABC＿transporter-like＿ATP-bd、ABCG＿dom、ABC＿2＿trans结构域,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,存在跨膜结构,主要定位在细胞膜上,预测NtABCG6L是一个跨膜转运蛋白。NtABCG6L蛋白与烟碱可以通过氢键结合,结合能为-2.95。 NtABCG6L基因主要在烟草根部表达,打顶14 d表达量最高,其表达量与烟碱转运系数呈显著正相关关系,初步推测NtABCG6L基因参与了烟碱的转运过程。本研究结果可为进一步采用基因编辑技术明确其功能提供依据。     

人乳头瘤病毒16L1蛋白的原核表达及免疫原性研究

采用聚合酶链反应技术从宫颈癌组织中获得人乳头瘤病毒(HPV)16L1基因,克隆到pGEM—TEasy载体中,再连接到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、SDS—PAGE分析,用表达产物免疫小鼠,获得的血清进行间接免疫荧光检测。结果表明：获得的pGEX-6p-1-L1基因在大肠杆菌中能以谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的形式得到高效表达,表达产物免疫小鼠,间接免疫荧光显示免疫血清能与peDNA—L1转染的B16细胞呈现特异反应,说明体外表达的HPV16L1蛋白保留了天然蛋白的抗原性,可作为HPV的诊断抗原、免疫学分析和疫苗研制的原料。     

枳NLP转录因子克隆及其在不同水分条件下的表达

【目的】分析柑橘砧木枳（Poncirus trifoliata (L.) Raf.）参与氮素吸收与同化的重要转录因子NLP在干旱胁迫下的表达模式,为柑橘在干旱胁迫条件下对氮素吸收与同化的调控机理提供研究参考。【方法】以柑橘砧木枳为试验材料,在甜橙（Citrus sinensis (L.) Osb.）基因组数据库的基础上,利用生物信息学筛选获得甜橙NLP,并以此设计引物扩增枳NLP的CDS全长并测序。利用ClustalX和MEGA程序进行序列比对和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR技术分析不同水分条件下的枳NLP的表达模式。【结果】筛选并克隆获得了4条枳NLP序列,为PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7和PtNLP8。序列比对分析表明枳NLP之间的蛋白质序列一致性为45.13%,均具有明显的RWP-RK和PB1结构域。枳与甜橙的NLP蛋白质序列的一致性极高,分别为97.57%、96.47%、99.0%及97.33%。系统发育分析表明枳NLP可分为4个进化类型,与拟南芥的NLP分类一致,即PtNLP2与AtNLP1/2一类,PtNLP4与AtNLP4/5一类,PtNLP7与AtNLP6/7一类,PtNLP8与AtNLP8/9一类。在不同水分条件下,枳NLP的表达模式在叶与根中存在差异。随着基质水分含量的减少,枳叶NLP呈现先上升再下降的趋势。与对照（相对持水量为61.0%）相比,叶PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的表达量在相对持水量为15.4%时上调至最高水平,分别上调了2.9、3.5、5.9及2.8倍,之后持续下调;到相对持水量为9.4%时,其表达水平低于对照但无显著差异。而枳根NLP的表达量在对照中最高,后随着水分的散失呈总体下降趋势且差异显著,与对照相比,根PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的最大下调倍数分别为6.7、2.8、4.8及2.3。复水后,枳叶与根NLP的表达量低于复水前,且与对照差异显著。【结论】枳NLP的表达与土壤的水分条件密切相关。枳叶片NLP的表达水平在干旱胁迫前、中期上调,后期下调;而枳根NLP的表达水平在干旱胁迫下持续下调。其中,PtNLP2和PtNLP7的表达量在枳根响应干旱胁迫中变化较大。     

布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】 从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中,电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中,成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞,BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢,缺失株导致细胞大量脱落溶解,ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著（P＜0.01）, 而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组,LDH和IL-10均低于M5-90对照组,差异显著（P＜0.05）。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株,BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应,有细胞毒性作用,bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用,bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。     

Protective efficacy of an H5/H7 trivalent inactivated vaccine (H5-Re13, H5-Re14, and H7-Re4 strains) in chickens,ducks, and geese against newly detected H5N1, H5N6, H5N8, and H7N9 viruses

Some H5 viruses isolated in poultry or wild birds between 2020 and 2021 were found to be antigenically different from the vaccine strains(H5-Re11 and H5-Re12) used in China. In this study, we generated three new recombinant vaccine seed viruses by using reverse genetics and used them for vaccine production. The vaccine strain H5-Re13 contains the hemagglutinin(HA) and neuraminidase(NA) genes of an H5 N6 virus that bears the clade 2.3.4.4 h HA gene, H5-Re14 contains the HA and NA genes of an H5 N...     

油用向日葵GDSL脂酶/脂肪酶基因的序列分析

为挖掘油用向日葵中的GDSL脂肪酶基因,本研究以油用向日葵转录组测序得到的Unigenes为对象,筛选GDSL脂酶/脂肪酶基因并对其理化性质和序列结构等特点进行生物信息学分析。结果表明:油用向日葵中筛选到7个GDSL脂酶/脂肪酶基因,编码的蛋白质为稳定存在的亲水性蛋白,由255~396个氨基酸组成,分子量介于28.75~42.61ku,等电点分布在4.91~8.89;除unigene 60916外,编码的蛋白质都含有较多的跨膜区域和较高的磷酸化程度;α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构;进化树分析表明,这7个基因聚为三类,保守性较高,其中unigene 58624与AT4G01130.1在同一分支上高度保守,unigene 60916与AT1G74460.1相似度最高,含有多个α螺旋和β折叠,推测与种子的油脂代谢有关。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

甘蓝型低芥酸油菜单株产量基因效应的研究

用5×5半双列杂交研究甘蓝型低芥酸油菜单株产量的遗传,结果表明:供试的甘蓝型低芥酸油菜品系中,单株产量的遗传符合加性显性模型,显性性质为超显性,平均显性度为1.404。显性基因约为隐性基因的3倍多,并且多数增效基因表现显性,但也有显性的减效基因存在。单株产量的广义遗传力h_B~2=71.4％,狭义遗传力h_N~2=33.18％。供试亲本显性效应的强弱依次为81007>81006>81018>81004>81033,增效基因的多少依次为81018>81006>81007>81004>81033。一般配合力的大小依次为81018>81006>81004>81033>81007。     

奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法的建立

为了弥补血清学和细菌学方法检测和诊断奶牛布鲁氏菌病存在的不足,根据编码牛种布鲁氏菌31KDa外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了1对PCR引物,通过对影响PCR扩增条件的优化,建立了快速检测奶牛布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,在同一反应条件下,该引物对引起奶牛布鲁氏菌病的牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出384bp目的基因片段,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、马流产沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌制备的模板分别进行扩增均呈阴性。敏感性检测显示,最低可检出1.5pg的模板DNA。结果表明:本试验所建立的奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。