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羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。 相似文献
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端粒酶在细胞永生化中的应用 总被引:1,自引:1,他引:0
细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体,而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此,将外源性端粒酶逆转录酶(TERT)基因转染至目的细胞,则可能诱导细胞发生永生化。本文从端粒、端粒酶、端粒酶在细胞永生化中的应用、端粒酶在传代细胞系中的应用、存在问题与展望等五个方面进行了综述,以期为相关研究人员提供参考。 相似文献
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人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力,是一种理想的细胞来源,在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。 相似文献
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蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。 相似文献
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正进行肠上皮细胞的分离培养是研究小肠功能、营养物质吸收机制及其调控的主要手段之一。本文综述了国外已经建立的几种特殊的肠上皮细胞系。细胞培养物基本上分为两种类型:(a)原代细胞培养和(b)连续细胞系。原代细胞直接分离自一个有限寿命的物体,而连续细胞系,也称确立细胞系或无限增殖化细胞系,具有持久的增殖能力。有几种方法可实现细胞的无限增殖:肿瘤细胞和未分化的细胞具有天生的不死特性,而正常细胞可 相似文献
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永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系的建立 《畜牧与饲料科学》2021,42(3):1-6
[目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型。[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞(ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs),利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞。采用RT-PCR、Western Blot检测F15和F35代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F35代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力。[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs。[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系。 相似文献
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实验旨在研究TCF21基因在鸡前脂肪细胞增殖过程中的功能。以鸡永生化前脂肪细胞系(ICP1)和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞为实验材料,首先利用qRT-PCR实验方法分析TCF21在ICP1细胞和鸡原代前脂肪细胞增殖过程中的表达规律,其次利用CCK-8比色法研究过表达和干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖过程中细胞数的影响,最后利用qRT-PCR实验方法分析细胞增殖过程中标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的表达情况。结果表明:TCF21基因在ICP1细胞和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞的增殖过程中均呈下降趋势;过表达TCF21基因抑制鸡前脂肪细胞的增殖,且细胞增殖标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的mRNA表达水平下调;干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖无明显影响。综上所述,TCF21可能对鸡前脂肪细胞的增殖有一定的抑制作用。 相似文献
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为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系. 相似文献
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陶海静 《上海畜牧兽医通讯》2014,(2):98-99
<正>《动物细胞培养技术》课程的实验教学目的在于使学生熟悉和掌握有关动物细胞培养的基本技术,并为其今后的就业创造条件。本文结合多年的教学实践经验提出了几点教学建议。1让学生明确动物细胞培养技术是病毒疫苗生产过程中最基本的应用技术动物细胞培养技术是指将动物细胞在体外条件下进行培养的技术,动物细胞培养技术可分为原代培养技术和传代培养技术。不管是原代培养技术或者是传代培养技术,在动物疫苗的生产中都应用的十分广泛〔1〕。授课时,一些具体的实例将有助于学生的理解,比如鸡法氏囊细胞疫苗是使用原代 相似文献
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将猪细小病毒S-1A株在不同的细胞中培养,测定病毒含量,以确定适合猪细小病毒S-1A株增殖的细胞。结果表明:猪细小病毒S-1A株能在猪肾传代细胞系(PK-15)、猪肾原代细胞(PK)、猪睾丸细胞(ST)和仔猪肾细胞(IBRS-2)中生长增殖,不能在幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)、绿猴肾细胞(Vero)和鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖;当ST细胞生长至2/3单层时,将猪细小病毒S-1A株种毒液100倍或1000倍稀释后接种ST细胞,37℃培养96~144h,获得的病毒载量最高。 相似文献
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为研究细胞信号转导和骨架在人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞中的作用,分别用酪氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白激酶C、Ca2+通道等信号转导抑制剂染料木黄酮、原钒酸钠、星状孢子素、硝苯地平和微丝蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B处理鸡肠上皮原代细胞后,采用细胞免疫组织化学染色检测人源福氏志贺菌ZD02株对鸡肠上皮原代细胞侵袭率,用间接免疫荧光双重标记检测ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞后F-肌动蛋白分布的变化。结果显示,染料木黄酮、硝苯地平和细胞松弛素B能显著抑制人源福氏志贺菌ZD02株内化,星状孢子素和原钒酸钠对ZD02株的内化无影响,人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞时F-肌动蛋白发生聚集。本研究表明人源福氏志贺菌ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞过程中需要酪氨酸蛋白激酶、Ca2+通道活化以及细胞微丝重排。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(10):1862-1867
为了克服鸡传染性喉气管炎弱毒活疫苗产品制备中存在的缺陷,通过对BHK-21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞(CEF)、原代鸡胚肝细胞、原代鸡胚肾细胞等六种细胞进行病毒适应性培养,采用PCR和免疫荧光(IFA)跟踪检测的方法成功筛选出具有稳定病毒滴度的病毒适应性细胞——鸡胚肝细胞。然后采用新的克隆方法缩短了克隆时长并对筛选的鸡胚肝细胞进行克隆纯化,通过与原代鸡胚肝细胞进行比较,结果显示本试验所采用的克隆方法具有高几率的特点,并且能够克隆出高活性的鸡胚肝细胞,并能够繁殖较高效价的鸡传染性喉气管炎病毒,为解决鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗在生产上存在的瓶颈问题提供了重要的基础条件。 相似文献
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本研究旨在确定犬原代软骨细胞及永生化软骨细胞的生理特点和功能特点。通过引入人端粒酶逆转录酶的催化组分使软骨细胞永生化。原代软骨细胞失去它们的特征表型和生长特性,而永生化软骨细胞则以较快的生长速度保持多边形。原代软骨细胞中软骨细胞特异性标记的表达急剧减少,而软骨细胞非特异性基因的表达反而增多。单层细胞中永生化软骨细胞不表达软骨细胞特异性基因。原代软骨细胞和永生化软骨细胞均包封于海藻酸微球建立三维培养体系。原代软骨细胞和端粒酶转染细胞在藻酸盐培养物中均采用软骨细胞特异性基因表达类型。因此,端粒酶的表达可能代表软骨细胞无限制膨胀,且在三维培养体系中维持软骨细胞特异性表型。这些细胞为测试不同组织工程学在犬模型上的应用提供了标准化工具。 相似文献