甘草酸体外抗PRRSV的作用机制

为了研究甘草酸体外抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的作用及机制,本试验确定了甘草酸的抗PRRSV作用,并通过检测甘草酸对病毒的吸附侵入、核酸复制等环节对病毒的结构蛋白、非结构蛋白以及宿主细胞受体和IFN-α表达的影响确定甘草酸体外抗PRRSV的作用机制。结果显示,甘草酸阻断PRRSV感染时减少了GP4的表达,并降低CD163和CD151的表达;抑制PRRSV吸附时抑制了PRRSV GP4和细胞CD163的表达;抑制PRRSV侵入时抑制了GP4的表达,并显著提升细胞CD163和CD151的表达;抑制增殖的作用机制是抑制细胞内PRRSV nsp9和nsp10的表达,前期抑制病毒引起的TLR3表达升高的趋势,后期促进TLR3的表达;中后期降低、末期促进IFN-α的表达。结果表明,甘草酸能通过调节PRRSV的蛋白、宿主细胞受体和细胞因子的表达来抑制PRRSV体外感染Marc-145细胞。     

Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在PRRSV-ADE感染中的作用

为了研究Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗体依赖性增强作用(ADE)感染中的作用,对2种结构域蛋白进行表达、纯化,并免疫大白兔制备其特异性多克隆抗体IgG。应用制备的抗Sn-N-V-set IgG、CD163-SRCR5 IgG和正常兔IgG分别封闭PAMs细胞,然后使用猪抗PRRSV IgG与PRRSV悬液混合后制成的感染性免疫复合物感染已封闭的PAMs细胞。感染后每隔12 h收集细胞上清液1次,用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法测定PRRSV的RNA拷贝数,同时以Marc-145细胞测定PRRSV的病毒滴度。结果显示,当Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域被其特异性抗体封闭后,能够显著抑制体外PRRSV感染PAMs细胞的抗体依赖性增强作用(ADE)(P<0.01)。结果表明,2种受体结构域均参与PRRSV-ADE感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要是通过与宿主细胞表面的特异性受体结合,利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。作者对猪繁殖与呼吸综合征病毒相关受体的研究进行了综述,迄今已报道了5种独立的但功能相关的受体:硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、波形蛋白、CD163和非肌肉肌动蛋白ⅡA。对受体的功能特性进行研究,将为PRRSV的感染机理和病毒性疾病的预防和治疗具有重要的意义。     

CD163与猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

猪繁殖与呼吸综合征,又称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染、引发的猪的一种流行性传染病。PRRSV病毒通过感染机体的巨噬细胞或单核细胞,进一步引发怀孕母猪妊娠后期流产或胎儿死亡。同时,该病毒感染仔猪后,可引发机体较为严重的呼吸系统相关疾病。目前研究发现,PRRSV在感染过程中,需要与CD163蛋白分子结合,从而介导其自身的膜结构与宿主细胞膜进一步融合,从而感染宿主细胞。本文系统地介绍了PRRSV的基因组结构、感染途径以及与CD163蛋白的相关性,以期为进一步研发相关抗体及生产蓝耳病抗性的猪种奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,对PRRSV细胞受体的研究将有助于揭示PRRSV的感染途径、复制过程、致病机理和疫病预防及控制等一系列问题,细胞受体的研究已经成为目前PRRSV研究中的重要领域。论文从硫酸乙酰肝素受体、唾液酸黏附素受体、CD163分子、波形蛋白等方面综述了PRRSV细胞受体研究进展。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

PRRSV清道夫受体CD163基因的真核表达和功能鉴定

从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中提取总RNA为模板,采用RT-PCR法获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的受体CD163全基因,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HIS A上,构建出真核重组质粒pcDNA3.1-CD163,经酶切和DNA测序证明获得了CD163基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.37%。将测序正确的CD163基因在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了CD163在PK-15中的表达。将转染的细胞感染PRRSV后,经IFA检测转染CD163的细胞能够被PRRSV感染。     

苦参碱对感染PRRSV Marc-145细胞受体表达的影响

为探讨苦参碱在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞过程中的抗病毒机制。本研究建立感染PRRSV的Marc-145细胞模型,将试验分为4组:细胞对照组、病毒对照组、苦参碱对照组和苦参碱试验组,每组重复3次。PRRSV感染细胞3,6,12,24h后,收集细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测苦参碱对PRRSV N基因及其细胞受体CD163、Vimentin和CD151的影响。结果表明,在PRRSV感染24h内苦参碱显著降低PRRSV N基因的表达(P0.05)。与病毒对照组相比,在PRRSV感染6h时,苦参碱可显著降低CD163的表达量(P0.05);在PRRSV感染3,6h,苦参碱试验组Vimentin的表达量显著降低(P0.05);在PRRSV感染3,24h时,CD151的表达量显著低于病毒对照组(P0.05)。以上结果表明苦参碱在PRRSV感染Marc-145细胞的不同时间点可通过抑制细胞不同受体的表达来抑制PRRSV吸附和侵入宿主细胞,从而干扰PRRSV在细胞中的复制。     

稳定表达猪CD163受体的MARC-145细胞系的构建

为了构建稳定表达猪CD163(pCD163)受体的MARC-145细胞系,从猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增pCD163基因,将pCD163基因克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中,获得重组质粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry。将重组质粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry与辅助质粒psPAX2、VSVG共转染293T细胞,获得具有感染能力的慢病毒粒子,使用慢病毒感染MARC-145细胞,用嘌呤霉素初步筛选阳性细胞,采用终点稀释法筛选出稳定表达pCD163受体的MARC-145细胞。通过RT-PCR扩增pCD163基因及测序分析表明细胞系基因组中存在pCD163受体编码序列,IFA和Western blot试验验证了pCD163受体蛋白在细胞系中稳定表达。用不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GXNN1396(lineage 8)、GXNN202004a(lineage 1)、GXGG202007(lineage 3)分别感染稳定表达pCD163的MARC-145细胞系与MARC-145细胞,PRR...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除载体的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因缺失细胞系和进一步明确CD163在PRRSV感染过程中的作用,本研究以猪基因组为模板,扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因同源左臂和同源右臂,并将扩增片段与pGEM-T载体连接后进行部分序列测定,同时与已知相应片段进行同源性分析,再将扩增的同源左右臂分别酶切后定向连接至pSSC-9载体中,成功构建了含Neo和Tk基因的双标记打靶载体pSSC-Larm-Sarm。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.     

CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages, iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染的特征,为深入研究CD163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD163单等位...     

茶皂素对PRRSV感染Marc-145细胞受体表达及Caspase-9活化的影响

以茶皂素(Teasaponin,TS)作为候选药物,研究茶皂素对Marc-145细胞受体CD163和波形蛋白(Vimentin)基因合成和蛋白表达的影响,以及茶皂素是否能通过细胞凋亡内源性通路影响PRRSV感染细胞,探究茶皂素抗PRRSV的作用机制。通过qRT-PCR和Western blot检测TS对细胞受体CD163和Vimentin的基因合成和蛋白表达的影响。运用Western blot技术检测TS对细胞内源性凋亡通路启动子caspase-9活化的影响,初探TS的抗PRRSV机制。qRT-PCR结果表明TS能显著抑制感染PRRSV的Marc-145细胞受体CD163和Vimentin基因的合成。Western blot结果表明TS能显著抑制细胞受体CD163和Vimentin的蛋白表达。TS能够引起细胞内源性凋亡通路启动子caspase-9的活化。研究表明,TS能抑制PRRSV在Marc-145细胞上的穿入过程,从而达到抗PRRSV的作用;亦可通过激活细胞凋亡内源性通路以早期促进细胞凋亡的方式产生抗PRRSV的作用。     

诱导猪肺泡巨噬细胞CD163受体表达的细胞因子筛选

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)中的CD163受体作为明星分子不仅参与正常的生理活动,而且作为重要的病毒受体介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵宿主靶细胞,因...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪后病毒与抗体消长规律

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种新的传染性疾病.猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖性增强作用(ADE),低滴度的特异性母源抗体或由免疫接种产生的低滴度的特异性抗体不但起不到免疫保护作用,还会使猪繁殖与呼吸综合征病毒更易进入血液中的单核细胞或肺泡中的巨噬细胞,促进猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制,导致长期的持续性感染,加重病情.     

PRRSV细胞受体CD163 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立

为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163在宿主感染PRRSV过程中的表达情况,根据CD163的序列在其保守区设计了1对特异性引物,基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立了一步法检测CD163的实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验及样品检测试验。结果表明:建立的方法具有较高的特异性,PRRSV的其他几个受体(CD151、HS)均为阴性反应;对CD163的检测下线为10个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对样品进行3次组内和组间重复试验,变异系数(CV)2%,具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间段CD163的转录水平进行检测,结果显示CD163在48小时时的mRNA含量明显高于其他各时间段。说明所建立的针对CD163的检测方法完全可以应用于临床样品的检测。     

PCV2与PRRSV体外共感染对肺泡巨噬细胞系炎症反应的影响

为了探讨猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)共感染后调控炎症反应的机制,选用稳定表达CD163的PAM细胞系3D4/21,分别设PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV(接种PCV2后12 h接种PRRSV)共感染组和对照组,利用间接免疫荧光检测(indirect immuno fluorescene assay,IFA)方法检测PCV2和PRRSV在PAM-CD163上的阳性率,采用RT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10表达量的动态变化。结果显示PCV2和PRRSV均能感染PAM-CD163;PCV2单独感染PAM-CD163,早期促进了IL-6、IL-8、IL-1β的表达,晚期促进IL-10表达;PRRSV单独感染PAM-CD163能在晚期促进IL-1β、IL-10的表达;与PCV2单独感染PAM-CD163相比,PCV2+PRRSV共感染促进了IL-10表达并且持续增加;与PRRSV单独感染PAM-CD163相比,PCV2+PRRSV共感染促使IL-6、IL-8、IL-1β的表达量较早出现增加,并且持续增加。可见两种病毒之间存在一定的相互作用,共同调节机体免疫系统。本研究结果有助于解析PRRSV与PCV2共感染调控炎症反应的机理。     

Ⅱ型PCV和PRRSV单独与共同感染未吃初乳猪病例人工复制

3周龄剖腹产不吃初乳(CD／CD)猪分别感染Ⅱ型猪圆环病毒(PCV—2)，猪繁殖—呼吸综合征病毒(PRRSV)，PCV—2和PRRSV共同感染，比较这些病毒的单独或联合作用。并于接种后不同日龄及猪濒死时剖检。接种后第10天(10DPI)，PCV—2和PRRSV共同感染猪出现严重的呼吸困难、昏迷，偶尔出现黄疽，10DPI后，91％死亡，20DPI时，全部死亡。PCV—2单独感染猪出现昏迷，散发性黄疽，42％出现渗出性皮炎，死亡率26％。PRRSV感染猪出现呼吸困难和昏迷，至28DPI时恢复。PCV—2感染猪和PCV—2／PRRSV共同感染猪皆出现与断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相同的组织病变。PCV—2／PRRSV共同感染猪亦出现严重的增生性间质肺炎和更相似的肝病变，出现极大量的含有PCV—2抗原的细胞。PRRSV感染猪出现中等程度的增生性间质肺炎，但未出现支气管或肝病变以及淋巴组织萎缩。研究结果表明：①PCV—2共感染能加重PRRSV对CD／CD猪引起的间质性肺炎的严重程度；②是PCV—2而不是PRRSV引起PMWS的淋巴组织萎缩，肉芽肿性炎症，坏死性肝炎等特征病变。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,该病毒自发现以来受到国内外学者的高度重视,对病毒结构蛋白的研究也正在逐步深入和完善.论文综述了近年来PRRSV结构蛋白的最新研究进展,特别对新发现的5a蛋白的结构与功能、决定病毒入侵的细胞受体及与其结合的病毒囊膜蛋白等问题进行深入分析,从而...     

板蓝根多糖在3D4/21/CD163细胞上对PRRSV感染过程的影响

以永生化的传代猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)作为靶细胞,研究板蓝根多糖(IRPS)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体外抗病毒效果.研究IRPS的最佳给药方式及其抑制病毒增殖的环节,分别以预防作用、直接杀灭作用和治疗作用来测定IRPS抑制PRRSV增殖的最佳作用方式和药物浓度;从IRPS对PRRSV的...