共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重...     

狂犬病病毒糖蛋白在毕赤酵母GS115中的表达及产物特性研究

本试验旨在利用毕赤酵母系统表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(GP)基因,并对重组蛋白进行反应原性研究。构建重组表达质粒pPiczαA-G,线性化后电转入酵母GS115中,经平板初筛及PCR鉴定正确后命名为pPiczαA-G-GS115。重组菌经1.0%甲醇诱导表达,对目的蛋白进行双抗体夹心ELISA检测、SDS-PAGE电泳、Western blot分析。结果表明,ELISA检测诱导72 h重组蛋白表达量最高;SDS-PAGE分析显示目的蛋白相对分子量约为65 kD,与理论值相符。Western blot结果表明,重组蛋白可与RV阳性血清发生特异性反应。本试验为进一步研制狂犬病病毒ELISA抗体诊断试剂盒奠定基础。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3～7基因特性研究

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用EcoRI和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAS1。用BstXI酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒S1蛋白基因在毕赤酵母中的表达

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用Ec0R I和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαASI。用BstX I酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

牛朊蛋白27-30基因的克隆与表达

利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

山羊痘病毒P32基因的克隆及毕赤酵母中的表达

将人工优化合成的山羊痘病毒P32基因和表达载体p PIC9K同时双酶切后相连,构建p PIC9K-IL-2重组表达载体。将线性化的载体p PIC9K-P32电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot。SDS-PAGE电泳显示出相对分子质量约为30 k Da目的蛋白表达条带,Western blot分析表明表达的蛋白具有反应原性。本研究成功构建载体p PIC9K-P32,并且P32基因已整合到酵母基因组中,为亚单位疫苗和鉴别诊断试剂奠定了基础。     

E.tenella河北株SO7基因在毕赤酵母系统中的表达及免疫保护力评价

为了确定重组质粒pPIC9-IL-2-SO7在毕赤酵母系统中的表达及重组蛋白SO7的免疫保护力,采用RT-PCR方法克隆E.tenella河北株SO7基因并测序,将目的基因与IL-2及真核表达载体pPIC9串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-SO7,转染毕赤酵母细胞GS115,SDS-PAGE电泳及Western blot方法验证其在毕赤酵母系统中的表达。将纯化后的重组蛋白SO7分别在雏鸡7,21日龄以50,100,150μg/只进行免疫,28日龄时,除阴性对照组外的其他试验组口服接种E.tenella孢子化卵囊8×10~4个/只,测定各组存活率、相对增重率、盲肠病变值和卵囊值,并计算抗球虫指数(ACI)。结果显示,阳性重组子具有2条带,分别为2 200,1 100 bp,表明成功将重组质粒pPIC9-IL-2-SO7转染毕赤酵母细胞GS115,Western blot检测证明表达的蛋白具有免疫原性;3个免疫组的ACI分别比阳性对照组提高了29.66%,33.33%和19.72%,其中以免疫剂量为100μg/只时,抗球虫效果最好。     

重组猪干扰素α6在毕赤酵母中表达及其活性研究

为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成Po IFN-α6基因片段,连接至pPICZαA质粒,构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6;经Sac I酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞,筛选阳性克隆;优化毕赤酵母表达条件,并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明,成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母,以1%甲醇诱导72 h后,菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带,Western blot检测为阳性;表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。说明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功,并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

E.tenella河北株EtMIC-2基因的克隆及毕赤酵母系统表达

为表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株EtMIC-2蛋白,本试验采用RT-PCR方法克隆出E.tenella河北株EtMIC-2基因,连接到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-EtMIC-2。将其线化后转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,饱和硫酸铵4℃沉淀浓缩后,用His选择镍-亲和层析柱纯化EtMIC-2蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot方法验证其蛋白的表达。结果表明,构建的重组表达载体pPIC9-EtMIC-2在毕赤酵母菌中表达出相对分子质量约为45 000的目的蛋白,表达的EtMIC-2蛋白能被E.tenella阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。为进一步研究EtMIC-2蛋白功能及构建DNA疫苗奠定基础。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。     

柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析

利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。     

鼠源REG3α二聚体蛋白的体外表达及抗肝癌细胞功能

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对鼠源胰岛再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,REG)REG3α二聚体进行表达,并对其体外抗肝癌细胞作用进行初步研究。通过DNA重组技术构建密码子优化的重组质粒pwPICZalpha-REG3α二聚体,用电转化的方法将线性化的重组质粒pwPICZalpha-REG3α二聚体导入毕赤酵母,经甲醇诱导表达重组蛋白,并用Ni-NTA Resin柱和阴离子交换柱对其进行纯化,用纯化后的蛋白进行体外抗肝癌细胞试验,通过MTT法测REG3α二聚体蛋白对肝癌细胞的半数有效浓度。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示在29.6 ku处有特异性条带,并且以剂量和时间依赖的方式抑制人肝癌细胞SMMC-7721的活性。研究表明获得了具有生物活性的鼠源重组REG3α二聚体蛋白,为进一步研究REG3α二聚体蛋白功能提供理论依据。     

类蜘蛛丝丝素蛋白SPF198在毕赤酵母中的分泌表达

将人工合成的长度为594 bp的类蜘蛛丝丝素蛋白spf198基因克隆到表达载体pP iczαA并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Mut+(m ethanol utilization p lus)重组酵母株进行了表达。初步的研究结果显示,spf198基因在GS115酵母里可以正确表达。