猪源盖塔病毒Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体的制备及其免疫特性分析

采用RT-PCR技术扩增猪源盖塔病毒(Getah virus, GETV)的衣壳蛋白(Cap)与糖蛋白(E2)基因,构建了Cap与E2蛋白的原核表达载体pET-Cap和pET-E2,转化至BL21(DE3)诱导大量表达。纯化并复性原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了Cap蛋白和E2蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10~5以上。Western blot和免疫荧光(IFA)结果显示,Cap蛋白和E2蛋白多抗与GETV均有良好的反应性。本研究制备的Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体,为建立ELISA等检测方法以及GETV致病机制的研究提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)EP0蛋白进行原核表达并制备其多克隆抗体,试验以PRV HeN1毒株为模板,构建了EP0基因原核重组质粒pET28a-EP0,经测序鉴定后,将pET28a-EP0重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以表达重组蛋白His-EP0;确认重组蛋白His-EP0表达后,用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,进行Western-blot测定,用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光法测定多克隆抗体的特异性。结果表明：EP0蛋白原核表达成功,His-EP0蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白形式表达,大小在55～70 ku之间;EP0蛋白多克隆抗体制备成功,抗体效价在1∶160 000以上,且能与表达的重组蛋白His-EP0及PRV感染的细胞发生特异性反应。说明试验成功表达了EP0蛋白,并成功制备了EP0蛋白多克隆抗体,抗体效价可达到1∶160 000以上,且特异性较好。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(r NSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5C3)。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶6 400和1∶105。Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIR QMYGVN300。本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NA和NS1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为了获得检测禽流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白和非结构蛋白(NS1)的抗体,试验采用扩增NA、NA+、NS1和NS1+基因,连接原核表达载体p ET-32a进行原核表达,蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,获得NA、NA+、NS1和NS1+的多克隆抗体血清。结果表明:NA、NA+、NS1和NS1+多克隆抗体血清反应性良好,可以检测NA和NS1自身蛋白,且NA和NA+及NS1和NS1+多克隆抗体血清之间均具有良好的交叉反应。说明基因部分缺失对整个NA蛋白和NS1蛋白的抗原性影响不大。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12蛋白的表达与鉴定

本研究扩增了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Hu N4株的NSP12基因,将其克隆于pCold-Ⅰ载体中,获得重组质粒pCold-Ⅰ-NSP12,并转化于E.coli/BL21感受态细胞,在16℃条件下用1 mmol/L的IPTG诱导20 h后,用SDS-PAGE电泳检测表达产物,结果显示在大约18 kDa处出现目标蛋白。用PRRSV特异性阳性猪血清对表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示该蛋白可以被PRRSV阳性猪血清识别。将重组NSP12蛋白纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。在MARC-145细胞中,对获得的NSP12多抗血清分别进行Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定,结果显示本研究制备的NSP12多抗血清均可与感染的MARC-145细胞的PRRSV Hu N4株以及在MARC-145细胞中特异表达的NSP12蛋白发生免疫反应。PRRSV NSP12蛋白的表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NSP12在病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新发传染病病原。研究旨在对SVA的衣壳蛋白VP1进行原核表达,并制备其多克隆抗体。以SVA广西分离株SVA-GX01(GenBank登录号：MK039162)RNA为模版,通过RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,构建重组质粒pET-32a-VP1并转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。在非变性条件下,将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。纯化的多克隆抗体进行间接ELISA测定效价,同时进行Western blot与间接免疫荧光分析。结果表明,重组蛋白pET-32a-VP1在大肠杆菌BL21(DE3)以可溶性与包涵体两种形式表达,分子量约为49 kDa。纯化后多克隆抗体效价高达1∶64 000。Western blot与间接免疫荧光(IFA)分析显示,多克隆抗体能跟SVA抗原特异性结合。重组SVA-VP1蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

A组猪轮状病毒NSP3蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP3的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究将原核表达、纯化的重组NSP3蛋白(r NSP3)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA法筛选,得到一株能够稳定分泌抗Po RV(G9)的杂交瘤细胞株(5B8)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型;MAb细胞培养上清液效价为1∶103,western blot及间接免疫荧光结果表明该株MAb能够与Po RV反应。对NSP3蛋白进行截短表达,采用western blot试验确定所获得的MAb识别的抗原表位区域序列为290QDYD RTFL297。该MAb的制备为进一步研究NSP3蛋白的结构和功能奠定了良好的基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

禽流感病毒蛋白AM2的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

鸡源SAMHD1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡源宿主限制因子SAMHD1(chSAMHD1)的多克隆抗体,本试验根据chSAMHD1基因序列设计引物,扩增部分chSAMHD1片段,构建p ET-chSAMHD1原核表达质粒,并将其转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导和镍柱亲和层析纯化获得重组chSAMHD1蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗chSAMHD1多克隆抗体,通过Westernblot和IFA测定多克隆抗体的反应性。结果显示,chSAMHD1重组蛋白的相对分子质量约为75.0 k Da,与预期大小一致;重组蛋白以包涵体形式表达;所制备的chSAMHD1多克隆抗体效价达到1:512 000;IFA结果证实,本试验所制备多克隆抗体能够特异性识别DF-1细胞中过表达的chSAMHD1蛋白。以上结果表明,该研究成功制备了chSAMHD1蛋白多克隆抗体,从而为鸡源SAMHD1蛋白功能的深入研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

猪流感病毒（A／swine／Jiangsu／2／2006（H3N2）NS1基因表达产物分析

采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

新型鹅星状病毒ORF2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

以新型鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)ORF2基因为序列设计1对特异性引物,利用PCR方法进行扩增,将其克隆到原核表达载体pET-30a中,转化DH5α感受态细胞,经酶切鉴定及测序后,获得重组质粒pET30a-ORF2。随后转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白。将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗鹅星状病毒衣壳蛋白的多克隆抗体。结果:成功获得ORF2基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,大小约84 kDa,且均能与His单抗和鹅阳性血清特异反应。制备的多克隆抗体,Western blot检测能与重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测也能与新型鹅星状病毒发生特异性反应。本试验结果表明,原核表达的新型鹅星状病毒结构蛋白ORF2及制备的多抗均具有良好的免疫原性和反应原性,为新型鹅星状病毒检测方法的建立及ORF2基因功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。