泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒的体外抑制作用研究

为分析泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的体外抑制作用，本研究使用CCK-8法检测泽漆水提取物对非洲绿猴肾细胞(Vero CCL-81)增殖活力的影响，通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR方法检测泽漆水提取物对PEDV的抑制作用和时间依赖关系。以广谱抗病毒药利巴韦林(Ribavirin)为阳性对照药物，探究泽漆水提取物对PEDV生命周期各个阶段的影响。结果表明:1)泽漆水提取物浓度≤500 μg/mL时在12、24 和36 h细胞无毒性。2)泽漆水提取物以剂量依赖方式显著降低PEDV-N mRNA的表达量及PEDV 病毒滴度。3)泽漆水提取物可长时间有效抑制PEDV-N蛋白的表达，预防给药对PEDV-N蛋白表达无明显抑制效果。4)泽漆水提取物在病毒复制周期的吸附及复制增殖阶段对PEDV-N蛋白的表达具有显著抑制作用，在入侵阶段对PEDV-N蛋白的表达无明显抑制效果。综上，泽漆水提取物在体外对PEDV具有显著抑制作用，主要作用于PEDV生命周期的吸附和复制增殖阶段。本研究为深入挖掘泽漆抗病毒优势奠定了基础。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体(MAb),本试验将Vero细胞中增殖的PEDV超速离心纯化,作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术和PEDV重组S蛋白为基础的间接ELISA方法,制备并筛选能稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞;分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验,对单克隆抗体的亚型、特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明,本试验成功获得了1株稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞株5C3。MAb亚类鉴定为IgM,轻链为k型。杂交瘤细胞连续传至20代,细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价分别稳定在1∶600和1∶10 000。特异性试验结果显示,MAb不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪圆环病毒(PCV2)发生交叉反应。western-blot结果显示,MAb能特异性识别PEDV的重组S蛋白。IFA试验结果表明,MAb能与PEDV感染的vero细胞产生特异性荧光。说明本试验获得的MAb能特异性识别重组及天然的PEDV S蛋白,具有良好的抗原性和特异性。     

黄芩苷对胰脂肪酶的抑制机理研究

[目的]探讨黄芩苷的脂肪酶抑制机理。[方法]用分光光度法测定脂肪酶活性,研究了浓度、反应时间、加酶量和加入顺序对黄芩苷抑制胰脂肪酶的作用。[结果]在一定浓度下,黄芩苷对脂肪酶的抑制作用呈上升趋势;初期抑制率的上升幅度较大,随着黄芩苷浓度的增大,抑制率的增幅减小。15min内,抑制率随着反应时间的延长而增大;但当反应时间超过15min时,黄芩苷对胰脂肪酶的抑制作用趋于稳定。在0．2～1．0mg/ml的浓度范围内,酶量对抑制率的影响不明显。黄芩苷试剂与胰脂肪酶预热10min后,加入底物乳液进行反应的胰脂肪酶抑制率最高。黄芩苷对胰脂肪酶的抑制常数为0．505mg／ml,其抑制作用为非竞争性抑制作用。[结论]该实验证实了中药黄芩中黄芩苷具有抑制胰脂肪酶的作用。     

黄芩苷诱导大鼠气管上皮细胞Mx1和PKR表达的研究

为了研究黄芩苷能否诱导大鼠气管上皮细胞表达抗病毒蛋白,以体外培养的大鼠气管上皮细胞(tracheaepithelial cells,TECs)为模型,采用Western Blotting方法检测了不同质量浓度(10、20、30μg/mL)和不同时间段(6、12、24h)黄芩苷诱导TECs表达抗病毒蛋白(AVPs)Mx1和PKR的量。结果表明,黄芩苷在3个浓度梯度和3个时间段均可以诱导TECs分泌抗病毒蛋白Mx1和PKR;并在30μg/mL,24h时使TECs所产生的抗病毒蛋白最高。这一结果为体外筛选诱导TECs表达抗病毒蛋白的中药有效成分提供了参考,为进一步研究中药抗病毒机理提供了实验依据。     

6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ST）的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID₅₀,用细胞维持液配成100·TCID₅₀病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6n>种中药成分与病毒作用后,测定TGEVRT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200 μmol·L^-1;抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L^-1。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID₅₀为10^-6.25/0.1 mL;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5 μmol·L^-1时与100·TCID₅₀病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID₅₀为10^-3.75/0.1 mL,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10^-6.45/0.1 mL差异极显著（P＜0.01）;通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为：10^-4.75、10^-5.55、10^-5.55、10^-5.65、10^-5.75/0.1 mL,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显著;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著,有望被开发成抗病毒药物。     

中药复方抗鸡新城疫病毒作用研究

[目的]探讨中药复方抗鸡新城疫病毒（NDV）的作用机理,为临床合理使用抗病毒性药物提供科学的理论依据。[方法]以白花蛇舌草、金银花、黄芪和甘草组成中药复方,制备成中药复方流浸膏并配制成不同浓度梯度的药液;测定中药复方对鸡成纤维细胞（CEF）最大无毒浓度,并测定NDV在CEF上半数感染力（TCID50）;设中药复方不同浓度组,正常细胞和NDV感染细胞对照组,采用3种不同的作用方式作用于各组以检测中药复方抗NDV活性,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT法）测定OD值,以治疗指数为评价指标。[结果]中药复方对CEF的最大无毒浓度为2-6g/ml,NDV对CEF的TCID50为10-7.3;第①种作用方式中药复方的最小有效浓度是2-10g/ml,第②种作用方式为2-8g/ml,第③种作用方式为2-7g/ml。[结论]第①种作用方式对病毒的灭杀作用最强,第②种作用方式次之,第③种对病毒的灭杀作用最弱。表明中药复方不仅具有细胞外直接杀灭病毒作用,而且还具有抑制病毒吸附、穿入、复制和成熟的某一环节,为研究中药抗病毒的作用机理及临床应用提供了可靠的试验依据。     

猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58 ku;Western blot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的单克隆抗体(Mab),以原核表达的融合蛋白GST-N为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,利用重组蛋白His-N和Vero细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得3株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(5B2,3H1和4H5),单抗亚型鉴定均为Ig G1,轻链均为Kappa链。Western blot和间接免疫荧光试验结果表明,Mab能够识别重组N蛋白和PEDV。制备获得3株稳定性好、特异性强的Mab,可为今后建立检测猪流行性腹泻特异性诊断方法和研究PEDV核衣壳蛋白功能奠定基础。     

PEDV流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡

[目的]本试验旨在研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡的相关机制.[方法]用添加5μg·mL-1胰酶的Vero细胞成功扩增PEDV JS2013毒株后,采用倒置显微镜、间接免疫荧光、流式细胞术、Hoechst染色、细胞活...     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

氧化石墨烯基二维复合纳米片对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

为研发抗动物源性病毒感染的新型广谱纳米材料,将氧化石墨烯（GO）与二氧化锰纳米片（MnO₂ NSs）通过π-π堆叠作用制备合成二维复合纳米片材料（GO-MnO₂ NSs）,分别通过TEM、XRD、XPS对GO-MnO₂ NSs的形貌、结构、结晶度和元素价态进行表征,并采用MTT法对GO-MnO₂ NSs的细胞毒性进行测试。结果显示,625 μg/mL GO-MnO₂ NSs的细胞存活率超过85%;以猪流行性腹泻病毒（PEDV）作为冠状病毒的模式病毒,EC₅₀、间接免疫荧光和Western blot试验结果证实GO-MnO₂ NSs对PEDV感染具有显著的抗病毒活性。研究结果表明,GO-MnO₂ NSs能够清除由病毒感染引起的活性氧过表达并抑制细胞凋亡,同时还能上调细胞内干扰素和干扰素刺激基因（ISGs）等抗病毒因子的表达,从而有效抑制病毒感染。     

慢病毒介导PNX沉默细胞株的构建与鉴定

[目的]构建慢病毒介导的PNX沉默载体,感染GnRH分泌细胞(GT1-7)后进行筛选鉴定,获得稳定的PNX沉默细胞株。[方法]结合RNAi干扰技术构建出慢病毒沉默载体,在293T细胞中包装病毒并测定滴度。感染GnRH分泌细胞(GT1-7),嘌呤霉素筛选得到稳定细胞后利用Real-time PCR和Western blot检测PNX沉默效果。[结果]慢病毒介导的PNX沉默载体构建成功,包装的慢病毒成功感染GT1-7细胞,并且Real-time PCR和Western blot证实了PNX沉默细胞株的PNX沉默效果。[结论]成功构建了慢病毒介导的PNX沉默细胞株,为以后探索PNX对动物生殖发育的作用打下了基础。     

EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。     

黄芩中黄酮类化合物的定性与定量分析

[目的]提出一种用近红外光谱技术快速检测黄芩中黄酮类化合物的新方法j[方法]首先应用光谱仪获得4种黄芩的光谱曲线,用主成分分析法进行聚类分析,再结合人工神经网络技术建立模型进行检测。在主成分分析的基础上,以每一个样品的前8个主成分作为神经网络的输入节点,黄苓苷和汉黄芩苷2种成分类型作为神经网络的输出节点,建立一个8（输入节点）-13（隐含层节点）一2（输出节点）的3层人工神经网络模型。[结果]黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷这2项指标人工神经网络模型预测值的平均相对误差分别为3．87％和5．15％,与高效液相色谱法测定值的符合程度很高,该模型具有很好的预测能力。[结论]新模型可用于黄芩的质量检测和生产加工过程中的质量控制。     

4味中草药的体外抗TGEV试验

【目的】探讨黄芪、黄芩、大黄、金钱草体外对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的抑制作用。【方法】采用传统的水提法制备黄芪、黄芩、大黄、金钱草等中药的提取液,测定其对PK-15细胞的最大安全质量浓度。采用细胞病变观察法确定4味中草药对TGEV致PK-15细胞病变的抑制作用,并通过MTT法计算药物的最小抗病毒质量浓度和抑制指数。【结果】黄芪、黄芩、大黄、金钱草的最大安全质量浓度分别为50,12.50,6.25和6.25mg/mL。黄芩、黄芪能抑制TGEV对PK-15细胞的吸附,抑制指数分别为8和4;大黄、金钱草能直接灭活TGEV病毒,抑制指数均为8。【结论】黄芩、黄芪、大黄、金钱草体外对TGEV均有抑制作用。     

4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究

[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。     

微波辅助提取法提取复方中草药有效成分的研究

[目的]研究微波辅助提取法提取复方中草药的有效成分。[方法]采用乙醇回流提取法和微波辅助提取法提取复方中药中的有效成分,同时采用紫外-可见分光光度法测定了黄芩苷和葛根素的含量,并以黄芩苷得率和葛根素得率为考察指标,比较了2种不同提取方法的提取效果,同时研究了微波辅助提取法的微波作用时间对提取的影响。[结果]以不同浓度的乙醇进行回流提取时,黄芩苷和葛根素的得率随着乙醇浓度的增加先增大后减小;以微波辅助提取法进行提取时,浓度为60%乙醇提取的黄芩苷和葛根素的得率最高。当乙醇浓度为60%时,采用微波辅助提取法提取的黄芩苷和葛根素的得率均明显高于乙醇回流提取。最佳微波作用时间为15 min,此时黄芩苷得率和葛根素得率最高,分别是0.315 5和0.502 5 mg/g。[结论]采用微波辅助乙醇回流提取法可提高复方中草药中黄芩苷得率和葛根素得率。     

口服灭活猪流行性腹泻病毒后仔猪消化道特异性SIgA检测及相关性分析

[目的]本试验旨在建立一种口服免疫的评价方法。[方法]应用灭活猪流行性腹泻病毒(PEDV)口服免疫5日龄仔猪,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)检测免疫后28 d仔猪唾液、小肠黏液、大肠黏液、粪便及血清中特异性分泌型IgA(SIgA)抗体水平,采用空斑减少中和试验和荧光定量PCR(qPCR)方法评价消化道不同部位黏液抗PEDV水平,最后通过Spearman相关系数法分析比较消化道不同部位SIgA水平的相关性。[结果]小肠中特异性SIgA水平较高,大肠次之,而唾液和粪便均低于肠道中SIgA水平,且唾液、粪便和血清中SIgA水平与肠道中SIgA水平具有显著相关性;仔猪消化道不同部位的黏液具有一定抗病毒作用。[结论]首次证明仔猪口服免疫后消化道各段黏膜中SIgA水平的相关性,提示检测唾液、粪便和血清特异性SIgA水平可以评估猪群中口服PEDV的效果,为建立口服免疫评价方法提供试验依据。     

光质对黄芩毛状根生长及黄芩苷含量的影响

[目的]考察光质对黄芩毛状根生长和黄芩苷生物合成的影响。[方法]采用白光和蓝光(400～480 nm)照射(12 h/d)以及黑暗条件培养黄芩毛状根,并采用高效液相色谱法测定黄芩苷含量,考察光质对黄芩毛状根生长及黄芩苷含量的影响。[结果]光质对黄芩毛状根生长和黄芩苷含量均有影响;白光和蓝光培养的毛状根生物量无明显差别,且白光抑制黄芩苷的积累;黑暗条件下培养的毛状根生物量和黄芩苷含量均高于蓝光与白光条件培养的毛状根。[结论]黑暗更适合黄芩毛状根生长与黄芩苷合成。     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。