兔支气管败血波氏杆菌PCR快速检测方法的建立及应用

参考GeneBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为387bp的目的基因片段,优化PCR反应条件,建立了兔支气管败血波氏杆菌的PCR快速检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和巴氏杆菌均无交叉反应,且检出最低浓度为10pg,可用于临床检测。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用

建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fimN)序列设计了一对引物,扩增出大小为648bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均无交叉性反应。用该PCR法检测了从杨凌、咸阳采集的50份表现临床症状的兔呼吸道分泌物检出支气管败血波氏杆菌阳性35例,阳性率为70%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较,结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的3.89倍,是微量凝集法的1.94倍。     

猫杯状病毒、猫细小病毒、猫流感病毒和猫疱疹病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为建立快速检测猫科动物重要传染病的多重PCR检测方法,根据GenBank中登录的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)、猫流感病毒(feline influenza virus, FIV)和猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type 1,FHV-1)的相对高保守性基因ORF2、NSP1、M和UL27,分别设计4对特异性引物。通过对反应体系的摸索及优化,建立了可同时扩增FCV(257 bp)、FPV(380 bp)、FIV(519 bp)和FHV-1(761 bp)的四重PCR反应条件及体系。结果显示：能够在同一体系中用同一反应扩增出以上4种病毒基因,其重复性及特异性均良好,敏感性可达到10 copies/μL。用该方法检测69份口鼻拭子,结果发现FCV和FPV混合感染的阳性率为10.14%,FCV和FHV-1混合感染的阳性率为1.45%,FCV、FPV和FIV混合感染的阳性率为10.14%。结果表明：研究建立的四重PCR检测方法可对常见猫科动物病毒性传染病进行快速准确的鉴别诊断,而且为...     

猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立

对表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离得到的34株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb),采用针对Bb flagellum gene的一对引物进行PCR扩增,结果所有分离物均能扩增出237bp特异性DNA条带,与传统生化鉴定结果相一致,且其最小检出量为0.64pg;而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及大肠埃希氏菌均未能出现任何DNA条带。这表明,本试验建立的PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可靠性好等特点,可用于猪萎缩性鼻炎的临床诊断。     

马疱疹病毒1型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)的检测方法,本研究以EHV-1 gB基因的一段保守区域(1207 bp～1509 bp)作为检测的目的片段设计引物,通过对其反应条件的优化,建立了特异性检测EHV-1的SYBR Green I 荧光定量PCR方法.实验结果表明:该方法检测目的基因的灵敏度下限为10拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与马疱疹病毒4型(EHV-4)及其他马传染病病原体无交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2％.该方法检测速度快及高敏感性的特点为马鼻肺炎的防制提供了有力保障,同时也为进一步开展马鼻肺炎相关的研究提供了有效的辅助检测方法技术.     

猫疱疹病毒Ⅰ型荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

研究旨在建立实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type Ⅰ,FHV-1)的方法,用于检测临床上猫的上呼吸道传染病样本。据Gen Bank已发表的猫疱疹病毒的gE基因序列的保守区域设计并合成一对特异性引物及探针,建立FHV-1的实时荧光定量PCR检测方法,对此方法进行特异性、灵敏度及重复性的验证,并对广东佛山某流浪猫基地猫疱疹病毒的流行情况进行调查,即对该基地的94份临床样品进行检测。结果表明：研究成功建立了FHV-1实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,此方法特异性强,与大多流行的犬猫病毒均未出现交叉反应;敏感性高,最低检出限为10 copies·μL^-1;重复性好,批内变异系数为0.29%～0.71%,批间变异系数为0.88%～1.38%。应用此方法在94份临床样品中检出28份FHV-1核酸阳性样品。综上所述,研究建立的FHV-1荧光定量聚合酶链式反应方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,为临床上FHV-1...     

猪嗜淋巴疱疹病毒3型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

依据GenBank公布的猪嗜淋巴疱疹病毒3型(porcine lymphotropic herpesviruses 3,PLHV-3)DNA序列,设计特异性引物,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行试验。得出方法的线性范围为:8.2×101~8.2×107,灵敏度可达82个拷贝,方法的特异性高,只能检测pMD18-T/PLHV3重组质粒,另外5种对照病原均未检出;方法的重复性好,对不同浓度的pMD18-T/PLHV3重组质粒分别扩增6次,结果重复性好。使用建立的方法检测100份临床样品,同时与普通PCR方法比较,显示荧光定量PCR检出率比普通PCR高,具有较高的灵敏度和准确性。结果表明:建立的荧光定量PCR可用于PLHV-3的临床快速诊断。     

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。     

猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物flal和fla2，扩增出大小为237bp的目的基因片段，建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应；最低能够检出112．5pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液；结果，检出支气管败血波氏杆菌阳性42例，阳性率为87．5％。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较；结果显示，该PCR法的检出率是细菌检查法的5．25倍，是微量凝集法的1．75倍。     

支气管败血波氏杆菌的研究进展

支气管败血波氏杆菌是广泛感染多种哺乳动物,有时也感染人的一种常在病原菌。该菌属于波氏杆菌属,借其粘附素和毒素对宿主致病,引起感染动物的呼吸道疾病,并协同其他病原菌形成严重的肺部混合感染,备受人们的广泛关注。本文对该菌的形态特征、培养特性、抗原性、致病情况以及相关研究进展进行了简要概述,以提供人们对支气管败血波氏杆菌的了解。     

应用凝集反应检测猪支气管败血波氏杆菌感染

通过对支气管败血波氏杆菌(Bb)不同分离物的菌落形态、溶血特征、荚膜结构、血凝效价和结晶紫(CV)染色的测定,CV+菌落被鉴定为BbⅠ相菌株,CV-菌落为菌相变异株。采用BbⅠ相菌株制备凝集试验抗原,对贵州省不同猪群的血清样本进行Bb抗体检测。在未表现萎缩性鼻炎临床症状的猪群中,Bb抗体的阳性率为6.71%;在已发生萎缩性鼻炎临床症状的3个养猪场中,Bb抗体的阳性率高达61.36%。同时对屠宰场的成年猪血清样本也进行了检测,Bb抗体阳性率为8.92%,表明成年猪群中存在Bb隐性感染状态。     

鲤科疱疹病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速和敏感的检测鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)的方法,本研究根据CyHV-2 DNA聚合酶基因序列合成引物和TaqMan探针,建立了CyHV-2荧光定量PCR检测方法.结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在5拷贝/μL～5×108拷贝/μL具有良好的线性关系,相关系数为0.999;其最低检出量为5拷贝/μL,比普通PCR的敏感度高100倍.该方法仅对CyHV-2的靶基因序列进行扩增,而对锦鲤疱疹病毒、流行性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒及鲤春病毒血症病毒核酸扩增结果均为阴性.组内和组间重复试验变异系数的平均值分别为0.5％和0.3％,具有良好的重复性.与常规PCR相比较,该方法具有快速、敏感、特异及高通量检测等优点,适用于对CyHV-2的快速检测.     

禽波氏杆菌与支气管败血波氏杆菌的生物学特性比较研究

本试验从菌体形态，培养特性、生化特性，血清学特性、致病性，药敏特性等方面对禽波氏杆菌与支气管败血波氏杆菌进行了比较，结果表明：二者在形态结构，生化特性等方面比较一致，在培养特性，血清学特性，致病性等方面存在差异。     

猫疱疹病毒1型PCR检测方法的建立

为建立一种猫疱疹病毒1型的PCR检测方法,根据猫疱疹病毒1型的gD基因序列设计了1对特异性引物,以猫三联疫苗为模板,扩增出1125bp的目的基因片段,该产物序列与GenBank上公布的基因序列同源性为100%。特异性和敏感性试验表明,该方法对犬三联疫苗、猪伪狂犬病弱毒苗均无交叉性反应;并且最小可检出含有103个拷贝的样品。使用此PCR方法与间接免疫荧光分别对30个临床样品进行了检测,表明其可从24个间接免疫荧光检测阳性样品中检出23个阳性,符合率为95.8%。本研究初步建立了快速检测猫疱疹病毒1型的PCR方法,为猫传染性鼻气管炎的检验检疫及临床早期诊断奠定了基础。     

家兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

从2只病死幼兔的心血和肺脏中,分离到2株细菌,通过对其培养特性、形态学观察和生化特性的研究,初步鉴定为兔支气管败血波氏杆菌。     

火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物,建立检测HVT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99),熔解曲线分析显示该PCR扩增具有良好的特异性、敏感性和重复性,试验表明该方法最低检测浓度为7×101拷贝/μL。利用该方法对野生型HVT和rHVT-pmpD-N在体内和体外的复制特性进行检测,结果表明重组后的HVT与野生型HVT的增殖速度基本一致。本试验建立的检测方法能够快速检测HVT,准确率高,特异性好,具有较高的灵敏度和稳定性,为监测HVT体内和体外的病毒含量和复制情况提供了一种有效的手段。     

犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过分析对比GenBank公布的几株犬Ⅰ型腺病毒序列,针对犬Ⅰ型腺病毒特有的E3区,设计了1对特异性引物。对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件优化后,建立了犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法,并对40份CAV-Ⅰ人工感染银黑狐的粪便样品进行了检测。结果表明,与普通PCR相比,建立的犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性强的特点。该检测方法可用于Ⅰ型犬腺病毒的快速诊断与监测,并能够定量分析CAV-Ⅰ的感染程度。     

马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,使用该方法进行临床样本检测。结果显示,建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10² copies/μL,敏感性高;EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应,特异性强;批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示,阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见,本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求,且该方法敏感性高、特异性强、重复性好,为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank公布的兔多杀性巴氏杆菌16S r RNA和支气管败血波氏杆菌fim N基因序列,设计两对引物,在建立两种细菌单项PCR检测方法的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了两种细菌的双重PCR检测方法,用这两对引物对同一样品中的兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌核酸为模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的258bp和449bp的特异性片段,而对其他4种兔病原菌的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,对兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的最低核酸检出限分别均为1pg。通过对78份临床病料检测,将建立的双重PCR技术和单项PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的同时检测和鉴别诊断。