柑橘SCoT分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用

 采用正交设计方法,对影响柑橘SCoT-PCR反应的Mg2+ 、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA用量等因素进行优化,建立了适于柑橘的SCoT标记分析体系。20 μL反应体系中含有：Mg2+ 1.5 mmol · L-1,dNTPs 0.35 mmol · L-1,引物0.625 μmol · L-1,TaqDNA聚合酶0.25 U,模板DNA 10 ng。最适退火温度为49 ℃。利用该体系对Wan2橘橙 × Li2甜橙的杂交后代及沙田柚四倍体进行分析,扩增条带清晰,扩增产物在150 ~ 2 100 bp之间。7个引物在Wan2橘橙、Li2甜橙及其18株杂交后代中共扩增出74条带,多态性条带48条,多态性比率为64.9%,在相似系数0.85处,18株杂交后代可聚为5类,表明其具有较丰富的遗传多样性;11个引物在4株沙田柚四倍体及其二倍体亲本中共扩增出84条带,其中多态性条带46条,多态性比率为54.8%,聚类分析显示5株沙田柚遗传相似系数在0.785 ~ 0.880,在相似性系数0.825处可分为3类,3株同源四倍体分别聚在不同的位置,四倍体材料均发生了不同程度的遗传变异。研究结果表明建立的柑橘SCoT体系结果稳定,重复性好,可为柑橘遗传育种提供新的技术支持。     

菊属植物SCoT分子标记技术在遗传多样性分析中的应用

 采用正交设计方法,对Mg²⁺、dNTPs和引物浓度、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量等5个因素进行筛选,得到适于菊属植物的SCoT标记PCR反应体系,25 μL体系中含有：Mg²⁺ 1.2 mmol · L^-1、dNTPs 0.15 mmol · L^-1、引物0.8 μmol · L^-1、TaqDNA聚合酶1 U、模板DNA 50 ng。优化的最适退火温度为49.4 ℃。改进电泳方法,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法染色。运用不同倍性菊属材料基因组DNA对优化的SCoT-PCR反应体系进行验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明确立的菊属植物SCoT分子标记技术体系稳定可靠。利用该体系及筛选出的12个SCoT引物,对18份菊花近缘种属材料的遗传多样性及亲缘关系进行分析,共检测到209个位点,其中多态性位点数189个,多态性比率为90.43%。应用NTSYS-pc2.1软件,计算菊花近缘种属材料之间的相似性系数并采用不加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析,结果18份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为0.4516 ~ 0.7035,平均遗传相似性系数为0.58。聚类分析显示在相似系数0.530处可以将18份材料分成Ⅰ、Ⅱ两个大组,Ⅱ组包括芙蓉菊和绢毛蒿,其余16份材料属于Ⅰ组。Ⅰ组在相似系数0.615水平又分为6个亚组。结果表明SCoT分子标记体系适用于菊属及其近缘属种遗传多样性及亲缘关系的研究。     

枇杷SSR反应体系的建立及优化

为探索适宜枇杷的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化。结果表明：20uL反应体系中,Mg2＋、dNTPs和引物的最适浓度分别为1．5mmol．L-1、0．15mmol·L-1、0．2umol·L-1,Taq酶最适用量为1U,模板DNA最适用量为20ng;引物的最佳退火温度为51．0～60．0℃。利用该反应体系对17份枇杷种质进行扩增,电泳结果显示,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

多倍体与二倍体枇杷叶片特征及抗旱性初步分析

【目的】探讨多倍体与二倍体枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)叶片生理形态特征差异并进行抗旱性初步评价,为枇杷倍性鉴定及抗旱性评价提供参考。【方法】以4个系列18个不同倍性枇杷株系为试验材料,对各株系叶片的形态解剖结构、失水率(RWL)、营养元素含量、叶绿素(Chl)含量进行观察、测定和分析。通过隶属函数法,对其抗旱能力进行初步评价。【结果】枇杷叶片长度、宽度与倍性呈极显著正相关(p 0.01),叶形指数与倍性呈极显著负相关(p 0.01);10项枇杷叶片解剖结构指标与倍性关联度强弱排序依次为:下表皮、上角质层、海绵组织、叶片组织细胞结构疏松度(SR)、叶厚、叶片组织细胞结构紧密度(CTR)、下角质层、栅栏组织、栅栏组织细胞层数、上表皮,其中上角质层、下角质层、CTR与倍性呈负相关;在40℃下干旱处理6 h后,A系列、H系列、K系列失水率与倍性均呈负相关,在24 h后失水率与倍性呈显著负相关(p 0.05);氮(N)、磷(P)、钾(K)、铁(Fe)、叶绿素a(Chl.a)、叶绿素b(Chl.b)、总叶绿素含量Chl.(a+b)含量与倍性关联度强弱排序依次为:N、K、P、Chl.b、Chl.(a+b)、Fe、Chl.a,其中N、P、K含量与倍性呈负相关;参考枇杷叶片解剖结构与失水率进行抗旱性隶属函数分析‘:A313’(3x)‘、A322’(3x)‘、B350’(3x)‘、B431’(4x)‘、4X(2)’(4x)‘、H324’(3x)‘、K3’(3x)‘、K4’(4x)抗旱性均强于同系列二倍体。【结论】枇杷叶片生理形态指标可作为枇杷倍性鉴定的参考指标,抗旱性评价中的8个抗旱性强的多倍体枇杷材料可用于进一步抗旱性研究,培育多倍体可作为提高枇杷抗旱性的一种途径。     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

枇杷AFLP分析体系的建立与应用

为研究枇杷种质资源遗传多样性和亲缘关系的技术平台奠定基础,以来自5个不同国家43份枇杷种质为试材研究枇杷基因组AFLP反应体系。通过检测AFLP分析中DNA提取、酶切及连接、预扩增和选择性扩增的结果,对影响AFLP分析的主要因子进行分析,建立了AFLP分析体系。利用该体系并选用EcoRI—AGG+MseI—CAC引物组合对供试材料进行扩增,获得的条带清晰可辩,说明所建立的反应体系适合于枇杷进行AFLP分析。     

草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化

为利用SCoT技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物11个野生种和1个栽培品种为试材,采用L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优SCoT-PCR反应体系,即20μL反应体系中,含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq酶0.75 U、引物0.75μmol·L-1、模板DNA 40 ng,并对退火温度进行了优化,对电泳检测方法及草莓属植物DNA提取方法进行了改进。共筛选出22个适于进行草莓属植物SCoT分析的引物。经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的SCoT分析。     

枇杷iPBS分子标记的PCR体系优化与引物筛选

以枇杷的DNA为模板进行iPBS-PCR扩增,采用预备试验中效果较好的iPBS分子标记引物2241,对枇杷iPBS-PCR反应体系中的dNTP、Mg2+、引物、模板用量进行优化。根据检测结果确定枇杷iPBS-PCR使用10×Taq buffer 2μL,25mM Mg2+1.6μL,2.5mM dNTP 1.6μL,10μmol/L Primer 1μL,5U/μL Taq酶0.2μL,模板DNA 5ng的20μL反应体系。反应程序中的退火温度可以参考iPBS引物理论Tm值。对33条iPBS引物扩增测试的结果显示在该反应体系下可以筛选到谱带清晰、多态性好的引物22条,可用于枇杷的分子标记分析。     

SRAP分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用

以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物组合对西班牙枇杷品种Javierin进行了SRAP分析体系的优化,结果表明,在25μL反应体系中,5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:dNTPs0.3mmol/L,Mg2+2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng,优化的扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min30s,5个循环;之后94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min30s,35个循环;最后72℃下延伸10min。并将该优化的体系在来自中国、西班牙、日本、意大利和美国的46份枇杷种质资源上进行了SRAP扩增的初步应用,经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳均获得了清晰、重复性好的SRAP指纹图谱。     

番茄SRAP-PCR反应体系建立与优化

利用正交实验设计L16(45)对番茄SRAP-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)在4个水平上进行优化试验研究。结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:Mg2+dNTPs引物Taq DNA聚合酶模板DNA;建立的番茄SRAP-PCR最佳体系(25μL)为:Mg2+2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、dNTPs0.25mmol/L、引物0.4μmol/L、模板DNA 80ng。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

栎叶枇杷、大渡河枇杷和普通枇杷遗传关系的形态学分析

对四川省石棉县和汉源县的普通枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.、大渡河枇杷E.prinoides Rehd.et Wils.var.daduheensis H.Z.Zhang和栎叶枇杷E.prinoides Rehd.etWils.的叶片、果实、种子等性状进行调查考证。结果表明,大渡河枇杷的各种性状都处于另两种枇杷间;大渡河枇杷不同单株的许多性状有不同程度分离,有些偏向于栎叶枇杷,有些偏向于普通枇杷,支持大渡河枇杷为栎叶枇杷和普通枇杷种间杂种的结论。     

杜鹃花ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以杜鹃花为试验材料,采用正交实验方法,研究模板DNA浓度、ISSR引物浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度等5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响,以建立适合杜鹃花的ISSR-PCR最佳扩增体系。结果表明:杜鹃花ISSR反应体系的最佳条件为模板DNA用量为60ng/20μL,ISSR引物浓度0.60μmol/L,dNTPs浓度0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度30U/mL,Mg2+浓度为0.6mmol/L。采用该反应体系可以从10份杜鹃花(R.simsii)基因组内扩增出稳定性高、重复性好ISSR-PCR产物。该研究为杜鹃花的遗传多样性分析、ISSR指纹图谱构建、亲缘关系鉴定等研究奠定了基础。     

黄皮ISSR分析体系的建立与优化

以广西无核黄皮为试材,采用改进的CTAB法提取高质量总DNA模板.对PCR循环次数、Mg2 浓度、退火温度、DNA聚合酶浓度等影响ISSR反应的主要因子进行了优化和筛选,建立了标记点位清晰、稳定、重复性好、适宜黄皮ISSR分析的反应体系;为在DNA分子水平上进一步运用ISSR标记对黄皮种质资源进行分析奠定了基础.     

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。     

全缘叶绿绒蒿ISSR体系的建立与优化

以全缘叶绿绒蒿的DNA为模板,利用正交实验设计,研究了Mg~(2+)、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA这5种PCR反应成分对反应体系的影响,以期建立并优化一个适合全缘叶绿绒蒿的ISSR反应体系,并用优化的体系对UBC公布的100条ISSR引物进行筛选。结果表明:在50μL优化后的反应体系中,含3 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、2mmol·L~(-1)dNTPs、0.4mmol·L~(-1)引物、1.25UTaq DNA聚合酶、60ng DNA。通过梯度PCR仪检验,确定了适宜的退火温度、延伸时间和循环次数。利用该体系共筛选出16条ISSR引物,并对全缘叶绿绒蒿共10株个体材料进行扩增检验,获得了较好的扩增效果。利用该体系,可为今后ISSR标记在绿绒蒿属植物的种质鉴定和遗传多样性分析等方面的应用提供一定的试验基础。     

无患子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的建立与优化

应用改良CTAB法提取了无患子基因组DNA,该方法具有操作过程简单、耗时少、能有效降低无患子基因组DNA提取过程中酚类化合物、多糖等杂质的污染。正交试验研究了dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶这3个因素对ISSR-PCR反应的影响,建立并优化了适合于无患子ISSR-PCR的反应体系。优化的反应总体系20μl含1×PCR Buffer,0.4 mmol.L-1dNTP,0.8μmol.L-1引物,0.75 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。使用此ISSR扩增反应体系,获得了部分不同种质无患子DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。优化的反应体系为后续无患子遗传多样性的研究奠定了基础。     

沙田柚多倍体遗传差异的SSR分析

应用21对柑橘SSR引物对7份有沙田柚血缘的不同倍性材料进行了基因组的遗传差异分析。平均每对引物扩增出3个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数目为2～5个不等,多态性带纹为62.5%。NTSYS软件进行相似系数计算,7份材料的相似性系数为0.763～0.892。UPGMA法聚类分析,在相似性系数为0.83处可划分为3类,即3株天然四倍体为第Ⅰ类;2株人工同源四倍体与1株天然三倍体为第Ⅱ类;二倍体母株为第Ⅲ类。天然三倍体与二倍体的遗传相似性较四倍体与二倍体的遗传相似性更高。4对引物(CAT01,TAA33,AG14 and TC26)可以区分天然四倍体与人工同源四倍体。与亲本二倍体母本相比,所试三倍体和四倍体均发生了DNA水平变异,表现为带纹缺失同时又增加了新的带纹。这些多倍体试材可为培育无核三倍体柑橘提供丰富变异的亲本材料。     

玉树地区独一味ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立玉树地区独一味的简单重复序列区间聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系并筛选出引物,采用M2+、DNA Taq酶、dNTP、模板DNA和引物进行5因素4水平正交实验,对独一味ISSR-PCR反应体系进行筛选.结果表明:最佳反应体系(25μL)为:10×PCR Buffer,75 ng模板DNA,0.75 μmol/L引物,0.5 UTaq DNA聚合酶,1.25 mmol/L MgCl2,0.05 mmol/LdNTP.然后确定了引物的最佳退火温度,并筛选出811、818、825、826、834、835、836、840这8条丰富多态稳定扩增的引物.该研究建立的玉树地区独一味ISSR反应体系具有稳定、清晰以及重复性好等特点,可为该区独一味的繁育系统和遗传多样性的进一步研究提供参考.