枇杷iPBS分子标记的PCR体系优化与引物筛选

以枇杷的DNA为模板进行iPBS-PCR扩增,采用预备试验中效果较好的iPBS分子标记引物2241,对枇杷iPBS-PCR反应体系中的dNTP、Mg2+、引物、模板用量进行优化。根据检测结果确定枇杷iPBS-PCR使用10×Taq buffer 2μL,25mM Mg2+1.6μL,2.5mM dNTP 1.6μL,10μmol/L Primer 1μL,5U/μL Taq酶0.2μL,模板DNA 5ng的20μL反应体系。反应程序中的退火温度可以参考iPBS引物理论Tm值。对33条iPBS引物扩增测试的结果显示在该反应体系下可以筛选到谱带清晰、多态性好的引物22条,可用于枇杷的分子标记分析。     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

偃麦草SRAP-PCR反应体系优化

以偃麦草叶片DNA为模板,利用单因子和L16(45)正交实验设计对影响偃麦草SRAP-PCR反应效果的Mg2+、引物、dNTPs、DNA、Taq DNA聚合酶5种因素进行优化,并比较了不同退火温度对扩增反应的影响,通过综合比较分析建立偃麦草SRAP-PCR的优化反应体系。结果表明:优化的偃麦草SRAP-PCR总体系20μL中,Mg2+1.75 mmol/L,引物0.15μmol/L,dNTPs 0.20mmol/L,DNA 50ng,Taq DNA聚合酶0.75U,2μL 10×PCR buffer;Mg2+和引物浓度对扩增效果影响最大,DNA浓度影响最小;采用该体系对32份偃麦草进行验证,扩增结果清晰稳定,此体系的建立为利用SRAP分子标记进行偃麦草遗传多样性、抗性标记等研究奠定了技术基础。     

杜鹃属ISSR-PCR反应体系优化

为了优化杜鹃属ISSR-PCR反应体系,以“毛叶杜鹃”叶片为试验材料,应用正交试验与单因素试验相结合,对PCR反应体系的因素Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物及DNA模板进行优化组合,确定杜鹃属植物ISSR-PCR的20μL最优反应体系为:Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、模板DNA 20ng、引物0.9μmol/L、d NTPs 0.2mmol/L。     

利用正交试验建立橄榄的ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计,对影响橄榄ISSR-PCR的5个主要因素(Mg2+浓度、dNTP、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和引物浓度)在4个水平上进行优化筛选,建立了适合橄榄ISSR-PCR反应的最佳体系。即20μl体系中含有Mg2+3.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、模板DNA80 ng和引物0.25μmol/L,利用该体系对多个橄榄品种进行ISSR分析取得良好结果。     

番茄SRAP-PCR反应体系建立与优化

利用正交实验设计L16(45)对番茄SRAP-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)在4个水平上进行优化试验研究。结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:Mg2+dNTPs引物Taq DNA聚合酶模板DNA;建立的番茄SRAP-PCR最佳体系(25μL)为:Mg2+2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、dNTPs0.25mmol/L、引物0.4μmol/L、模板DNA 80ng。     

番茄EST-SSR标记PCR反应体系的优化

应用L16 (44)正交实验优化番茄EST-SSR标记PCR反应体系.结果表明:20 μL体系中各反应物最适浓度为:DNA模板45 ng/20μL,引物0.75 μmol/L,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs0.4 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U/20μL,且Mg2+对该标记反应体系影响最大.利用5对EST-SSR引物及P1、P2基因组DNA验证优化体系的可靠性,为该标记在番茄基因组分子标记辅助育种提供了试验依据.     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

正交设计优化大白菜ISSR-PCR反应体系

以大白菜为试材,采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取大白菜基因组DNA,采用正交实验设计方法,对dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、及模板DNA五因素四水平进行优化,筛选并建立了适合大白菜的ISSR-PCR反应体系。结果表明:25μL的反应体系中含有1.5mmol/L Mg2+、200μmol/L dNTP、0.5UTaq DNA聚合酶、0.7μmol/L引物、30ng模板DNA。在此基础上探讨了最佳循环次数,应用该优化反应体系,用3个不同循环数对资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系适宜的循环次数是30。     

小干松SRAP-PCR反应体系的建立

以小干松针叶基因组DNA为模板,采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Taq酶、Mg2+、dNTPs、模板DNA和引物5个因素在4个水平上进行优化.结果表明:小干松SRAP-PCR 20 μL反应体系最佳组合为:Taq酶0.5U,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTPs浓度0.15 mmol/L,模板DNA含量60 ng,引物0.2μmol/L.使用12对SRAP引物,采用优化后的体系进行SRAP-PCR反应,表明优化的体系很好地满足了小干松基因组DNA进行SRAP的扩增要求.     

正交直观分析法和新复极差法优化苦瓜SRAP反应体系研究

以苦瓜为试材,采用正交直观分析法和新复极差法相结合的方法,对影响苦瓜SRAP反应体系的5种因素(dNTP浓度、模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度及Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化筛选,以期优化苦瓜SRAP的PCR反应体系。结果表明:苦瓜SRAP分析的优化反应体系为20μL PCR反应体系中含有1×PCR buffer,250μmol/L dNTP,50ng模板DNA,1.2μmol/L引物,1.5mmol/L Mg2+,1.5UTaq DNA聚合酶。     

正交设计直观分析法优化苦瓜SSR-PCR反应体系

以苦瓜‘MC9’为试材,采用L16(45)正交实验,对苦瓜SSR-PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA量、Taq聚合酶量、引物浓度等5个因素的4个水平进行优化试验,并通过正交设计直观分析法对Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶量进行了单因素确定。结果表明:最佳反应体系为1μL 10×PCR buffer,Mg2+浓度为1.75mmol·L~(-1),dNTPs浓度为0.25mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1U,DNA 100ng,引物0.20mmol·L~(-1),ddH2O补足至10μL。     

国兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计与单因素结合法,对国兰ISSR-PCR反应体系中的4个因素(dNTPs、引物浓度、Mg2+、Taq DNA聚合酶)进行优化试验,结果用DPS软件进行分析.结果表明:各因素对PCR结果均有显著影响,其中Taq DNA聚合酶对反应的影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立国兰ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:dNTPs 0.2mmol/L、引物1.0 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶1U.     

应用正交设计优化江南牡丹RAPD-PCR反应体系

以牡丹品种"云芳"基因组DNA为模板,采用正交实验设计L25(55)对影响牡丹RAPD-PCR反应的5因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶)在5个水平上进行优化试验。结果表明:最佳的RAPD-PCR的反应体系为:20μL体系中含有25 ng的模板DNA,0.2μmol/L的引物,Mg2+1.0 mmol/L,1×buffer反应缓冲液,DNTPs各为0.2 mmol/L,1.0 U的TaqDNA聚合酶。     

利用正交设计优化辣椒SRAP反应体系

为快速建立优化的辣椒SRAP反应体系,利用L9(34)正交表,探讨了Mg2+、dNTPs、引物和模板DNA4种主要反应成分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响。结果表明:通过正交设计实验可高效建立优化稳定的辣椒SRAP反应体系;用该法建立的辣椒SRAP优化反应体系为:20μL反应体系中含10×PCRBuffer 2.0μL、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L,上下游引物各0.4μmol/L、模板DNA10 ng,TaqDNA聚合酶1 U。     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素（模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶）在4个水平上进行正交优化试验。结果表明：各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为：引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为：模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol?L-1、Mg2+浓度2.0 mmol?L-1、dNTPs浓度0.125 mmol?L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶)在4个水平上进行正交优化试验.结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+.建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为:模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol·L-1、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U.     

枇杷SSR反应体系的建立及优化

为探索适宜枇杷的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化。结果表明：20uL反应体系中,Mg2＋、dNTPs和引物的最适浓度分别为1．5mmol．L-1、0．15mmol·L-1、0．2umol·L-1,Taq酶最适用量为1U,模板DNA最适用量为20ng;引物的最佳退火温度为51．0～60．0℃。利用该反应体系对17份枇杷种质进行扩增,电泳结果显示,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

莲雾ISSR反应体系的优化与应用

以黑珍珠莲雾为试材,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行了优化筛选,结果表明,25μL ISSR反 应体系各组分的最适浓度分别为:1×Buffer(不含Mg2+)、2.0 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、Taq DNA聚合酶1.5 U、引 物0.2 μmol/L、模板1.0 ng/μL。此外,加入1.6％的甲酰胺有利于减轻背景噪音的干扰。并利用该优化体系对12个连 雾类型和2个近缘种进行了ISSR扩增,证实了该体系稳定可靠。