猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3蛋白的多克隆抗体,本研究通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-US3;然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1:10,000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与US3蛋白特异性结合。US3多克隆抗体的制备为US3缺失株的检测及进一步研究US3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备

利用大肠杆菌表达技术和亲和层析法纯化出重组PRRSV N蛋白 ,用间接ELISA法和Western blot分析 ,证明其具有较好的抗原性。将该纯化蛋白采用大剂量长程免疫法免疫家兔 ,制备了兔抗重组N蛋白抗体 ,用Western blot分析和竞争抑制试验证明其具有很高的特异性 ,ELISA效价达 1∶32 0 0以上。     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列(登录号:MG434500)设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380bp,可编码459个氨基酸,其中175-207bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 380bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）的核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白,并制备其多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a（+）中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37 ℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的纯化纯度可达90%、蛋白浓度为0.45 mg/mL;纯化后的多克隆抗体纯度较高,ELISA方法检测其效价为1∶6 400,能特异性地识别重组N蛋白和PDCoV,与可引起猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）无交叉反应。【结论】本研究成功制备重组PDCoV-N蛋白及其多克隆抗体,为后续深入研究N蛋白的功能、PDCoV优化血清学检测方法、免疫层析试纸条的制备及开展PDCoV相关基础研究提供参考。     

口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因的BSBSE片段的原核表达及抗血清制备

本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

鸡错配修复相关基因MLH1原核表达及抗体制备

为了更好地理解错配修复基因与禽类某些疾病的关系,研究制备了鸡错配修复重要标志性蛋白MLH1的多克隆抗体。首先克隆了鸡MLH1基因的部分保守序列,运用基因重组的方法构建了pET32a-MLH1原核表达载体,IPTG诱导后得到表达的重组蛋白,采用镍柱纯化法纯化重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,所得到的重组蛋白分子量与预测值一致,表明纯化得到了高纯度重组蛋白。以重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后制备抗血清。ELISA结果显示效价高于1∶20 000,Western blot显示抗体具有良好的特异性。本结果为检测鸡错配修复相关疾病发生中MLH1基因的功能研究提供了必要的抗体基础。     

猪Viperin主要抗原区的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导5 h。采用His标签单抗对重组蛋白进行Western blot鉴定表明蛋白具有良好的抗原性。将蛋白质纯化后免疫新西兰大白兔,间隔14 d免疫4次,并采集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,结果表明,经过4次免疫血清抗体效价达到1∶409600,间接免疫荧光检测出现特异荧光,表明其能与Viperin蛋白发生反应。本试验为研究Viperin的功能、建立特异的检测方法奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒ns7、ns7a蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为获得免疫原性好的猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)辅助蛋白ns7和ns7a,并制备特异性的多克隆抗体,以用于ns7和ns7a蛋白功能的初步研究,本试验构建原核表达载体pGEX-PDCoV-ns7和pGEX-PDCoV-ns7a,测序正确后转入E.coli BL21(DE3)中诱导表达。利用GST-Resin进行蛋白纯化,将获得的重组蛋白以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠,成功制备4份PDCoV ns7和2份ns7a小鼠多克隆抗体,并用ELISA、Western blot和IFA对抗体效价、反应性及特异性进行鉴定。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了可溶性ns7和ns7a蛋白,制备的PDCoV ns7和ns7a多克隆抗体效价分别为1∶409 600和1∶12 800,并在Western blot和IFA试验中具有良好的反应性及特异性。结果表明,制备的PDCoV辅助蛋白ns7和ns7a多克隆抗体为深入研究ns7及ns7a蛋白的生物学功能提供了重要工具。     

弓形虫新的表面抗原SRS20A的鉴定及特征化

克隆弓形虫上海SHR株SRS20A基因,构建原核表达体系,通过诱导表达和蛋白纯化,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对蛋白进行特征化鉴定。采用PCR技术扩增弓形虫SRS20A基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,转化大肠埃希菌（E. coli）,IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,使用弓形虫阳性血清检测SRS20A蛋白的反应原性,应用纯化的rSRS20A蛋白通过ELISA方法对猪临床样品进行检测,利用Western blot技术检测多克隆抗体与弓形虫天然蛋白的反应性,通过间接免疫荧光观察SRS20A蛋白在虫体内的定位情况。成功从弓形虫基因组中扩增出SRS20A目的基因,构建了pET-30a-SRS20A重组质粒,利用小鼠感染弓形虫的阳性血清可以特异性识别重组蛋白rSRS20A,ELISA试验表明rSRS20A可以与猪临床血清特异性反应,证明SRS20A具有良好的反应原性。制备并获得了抗SRS20A重组蛋白的多克隆抗体,通过Western blot可检测出弓形虫天然蛋白SRS20A的特异性条带。通过间接免疫荧光方法鉴定S...     

猪圆环病毒3型Rep蛋白的表达与多克隆抗体制备

为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,Rep在大肠杆菌中获得大量表达,且主要以包涵体形式存在,重组蛋白相对分子质量约为32 000,经纯化后得到单一条带。表达的重组Rep蛋白可以与PCV3阳性血清发生反应。制备的大鼠抗Rep血清与表达的重组Rep蛋白发生特异性反应,且效价大于1∶32 000。表明本试验表达的Rep具有良好的免疫原性和反应原性,为PCV3的ELISA诊断试剂盒研制提供依据。     

双峰驼FCGRT基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备抗双峰驼FcRn的抗体,首先从NCBI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒pET-28a-FcRn,然后在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达及表达条件优化,用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔,制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体,并通过间接ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的FcRn重组蛋白与预期大小一致(34 ku),且以包涵体形式表达,其最佳IPTG诱导浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为6 h。ELISA检测抗体效价为1∶32 000,Western blot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合。说明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体。