鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定

山东、河北等华北地区12个肉鸡养殖场出现了以心包积液、出血性肝炎为特征的疾病,从采集的病料中进行病毒分离鉴定。本研究对分离的毒株进行PCR扩增、血凝试验、ELD_(50)测定、Hexon基因序列测定与分析以及人工感染试验进行组织病理学观察、抗体水平检测等一系列试验。结果显示,分离的毒株不能凝集鸡和鸭的红细胞,但能够凝集大鼠的红细胞,ELD_(50)为10-3.17/0.2mL。组织学变化显示肝细胞纤维化和脂肪变性,肾小管上皮细胞肿胀、变性,心肌纤维水肿、颗粒变性。对临床采集的血清检测结果显示发病鸡群抗体水平为阳性,发病鸡群中的健康鸡阳性率为40%(40/100),表明鸡群中存在隐性感染。将分离株的Hexon基因组与已发表的血清4型禽腺病毒基因进行同源性比较,发现该分离株与印度株在同一个分支上,同源性在99.6%以上,而与韩国、欧洲、美洲株同源性较远。用分离的毒株感染15日龄的雏鸡能引起心包积液、肝脏出血、肾脏肿大等病变。上述结果表明该分离株为血清4型禽腺病毒。     

禽腺病毒4型ZZ株的致病性研究

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染引起的心包积液综合征(HPS)病例在国内鸡群中持续增加,前期从患有HPS的病鸡样品中分离了 1株FAdV-4病毒(FAdlV-4ZZ)并获得了全基因组序列.本研究以FAdV-4 ZZ病毒株感染SPF鸡,从临床症状、存活率、组织病理学变化、病毒的组织分布情况对该毒株的致病性进行了评价....     

禽腺病毒血清4型贵州流行株分离及其致病性分析

为了解贵州地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的致病性和生物学特性,本研究对经PCR检测为FAdV-4核酸阳性的肝脏样本应用鸡肝癌细胞(LMH)进行FAdV-4分离培养,通过观察FAdV-4感染细胞病变,并应用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、电镜等技术对分离病毒进行鉴定;然后通过动物感染试验分析分离病毒的致病...     

血清4型禽腺病毒感染SPF鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律

为探究血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染SPF鸡后体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律,将FAdV-4人工感染3周龄SPF鸡,在感染后不同时间点采集11种组织器官,RT-PCR检测病毒的动态分布,同时定期检测感染鸡的呼吸道和泄殖腔的排毒情况.结果显示,SPF鸡感染后1～21 d胸肌、肝脏、心脏、脾脏、肺脏、腺胃、胰腺...     

禽腺病毒血清4型感染的LMH细胞mRNA表达谱分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的禽肝炎-心包积液综合征已严重危害我国养禽业的发展,迫切需要深入了解FAdV-4的致病机制并制定有效的防控方案。论文旨在利用高通量测序技术分析禽腺病毒血清4型感染鸡肝癌(Leghorn male hepatocellular, LMH)细胞后差异表达的mRNA,以探究mRNA在FAdV-4感染过程中的作用及其调控机制。结果显示,与对照组相比,FAdV-4感染48 h共筛选到2 604个上调的差异表达基因,2 883个下调的差异表达基因。其中,GNB3、NECTIN4、SFRP4、FABP2、PLPP3、GALR1L和MBL2等基因之前并没有被报道过与FAdV-4感染相关。通过GO和KEGG分析得知,差异表达基因主要富集在从细胞表面位点和信号受体结合至细胞周期调节、MAPK信号通路、细胞黏附分子作用等;其中,显著下调的差异基因还富集到多种代谢途径中,提示病毒感染会影响宿主细胞的代谢水平。本研究为深入解析FAdV-4感染宿主细胞的致病机制提供了相关的理论基础及科学依据。     

血清4型禽腺病毒研究进展

近年来,血清4型禽腺病毒（FAdV-4）在我国爆发,造成家禽行业严重的经济损失。病毒感染引起死亡率高,临床剖检可见明显的心包积液综合征的症状。病毒极具传染性,可垂直及水平传播,通过受感染肝脏组织匀浆可以分离和检测病毒。目前实验室诊断主要通过琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、限制酶分析、聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、高分辨率的融化曲线分析等进行检测。疾病预防主要通过灭活疫苗的接种,而减毒活疫苗和亚单位疫苗也相继被开发。对FAdV-4的流行病学、发病特征、病毒诊断方法以及预防策略等方面进行了综述,以期为FAdV-4的深入研究奠定基础。     

禽腺病毒强毒(FAdV-4)WZ株对SPF鸡和SPF鸭的致病性比较

对28日龄的SPF鸡和SPF鸭通过肌肉注射10^7.8 TCID₅₀血清4型禽腺病毒(FAdV-4) WZ株,系统比较了SPF鸡和SPF鸭的临床症状、大体病变、存活率、体质量、组织病理学变化,并通过实时荧光定量PCR方法检测组织病毒载量和泄殖腔排毒情况。结果显示,FAdV-4强毒株可致SPF鸡发生严重的包涵体肝炎-心包积液综合征(HHS)且导致100%死亡,在多种组织中观察到组织病理学损伤,并检出FAdV-4,且在感染后1 d即可检测到排毒。相反,SPF鸭在攻毒后14 d的观察期内均未出现发病和死亡;与对照组SPF鸭相比体质量增加趋势一致,差异不显著(P>0.05);剖检未见病变和组织病理学损伤;在鸭内脏组织样品和泄殖腔拭子中均未检出FAdV-4。结果表明,FAdV-4强毒株对SPF鸡具有很强的致病性,而对SPF鸭并无致病性。本研究通过比较FAdV-4强毒对鸡和鸭易感性的差异,证实FAdV-4强毒只感染鸡不感染鸭。     

血清4型禽腺病毒的实验室诊断方法研究进展

自2015年来,我国河南、山东、广东等地许多集约化家禽养殖地区均有血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染导致的心包积液综合征暴发,患病鸡死亡率较高,严重制约了我国家禽业的可持续发展。然而,目前对FAdV-4的分子流行病学和致病机制所知甚少,且国内尚无获批的商品化疫苗,给该病的防控造成了困难。本文对近年来FAdV-4的实验室诊断方法的研究进展进行了综述,以期为我国新发FAdV-4的防控提供理论依据和技术支撑。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型(FAdV-4)地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株(GZ-BJ株和GZ-QL株)的全基因序列,长度分别为43352、43723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42),二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

禽腺病毒4型感染病理组织学观察

将30只1日龄SPF鸡随机分为2组,其中攻毒组20只,对照组10只。攻毒组按每只0.2mL腹腔注射禽腺病毒4型(FAV-4)病毒液,对照组不做处理,隔离饲养,临床观察2周。攻毒后第3天攻毒组开始出现死亡,将死亡鸡解剖观察各器官大体病变,经聚合酶链式反应(PCR)检测为FAV-4后,采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏制作石蜡切片,观察病理组织学变化。结果显示,攻毒组死亡鸡只无明显临床症状而突然倒地死亡;主要剖检病变为心包积液、肝脏肿大,个别可出现脾脏肿大、肺脏淤血、肾脏肿大;病理组织学变化为肝脏、肺脏、肾脏淤血,细胞变性坏死;而对照组无任何异常症状和病理组织学变化。     

禽腺病毒血清4型感染引起宿主炎症信号通路变化的研究进展

禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是一种能引起家禽心包积液-肝炎综合征(hydropericardium-hepatitis syndrome, HHS)的双链DNA病毒。近年来,病毒感染引起宿主信号通路变化的研究备受关注,对机体信号转导通路的作用有了全新的认识。目前为止,研究发现FAdV-4感染引起宿主发生炎症反应的信号通路主要有TLRs、NF-κB、JAK/STAT、UPR、Caspase-1、LXR-α、JNK/MAPK、STING和TNF通路等。本文对FAdV-4感染引起宿主的相关信号通路变化进行阐述,分析由FAdV-4感染引起机体信号转导通路变化而产生的一系列炎症反应等,以期为进一步探索FAdV-4感染宿主诱导炎症的分子机制研究提供思路和参考。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型（FAdV-4）地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株（GZ-BJ株和GZ-QL株）的全基因序列,长度分别为43 352、43 723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF（22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42）,二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NL-RP3.以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线.通过反应条件...     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测试剂盒的研制及应用

为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型（FAdV-4）检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术（LFD）,优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克病病毒（MDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H9亚型（AIV（H9））、禽呼肠孤病毒（ARV）、FAdV标准株（FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11）、鸡大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（SA）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、鸡毒支原体（MG）的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4 ℃条件下至少可以保存3个月,在-20 ℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%（21/117）。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。     

血清4型禽腺病毒广西分离株单克隆抗体的制备及鉴定

为制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)广西分离株(FAdV-4-GX2018-005)的特异性单克隆抗体,将FAdV-4-GX2018-005作为免疫原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株制备腹水并纯化得到单克隆抗体,利用ELISA和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明,成功获得3株单克隆细胞株3A3、13A11和4D5。3株杂交瘤细胞株分泌的抗体,能与FAdV-4产生特异性反应,与其他血清型禽腺病毒(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)不发生反应。本研究成功制备FAdV-4广西分离株单克隆抗体,为FAdV-4检测方法的建立奠定了良好基础。     

禽腺病毒血清4型中国流行株fiber2蛋白单克隆抗体制备与鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)中国流行株的fiber2蛋白的特异性单克隆抗体。以纯化的FAdV-4中国流行株CH/HNJZ/2015免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,采用基于fiber2蛋白的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过5次亚克隆,获得2株分泌抗fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C3和7B4。以制备的2C3和7B4腹水进行亚型鉴定、反应原性、特异性以及中和活性测定。结果显示,成功制备了抗FAdV-4 fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,获得的单克隆抗体均为IgM亚型,可特异性识别FAdV-4及其fiber2蛋白,为FAdV-4的免疫检测和fiber2蛋白功能研究提供了研究材料。     

血清4型鸡腺病毒AHHN分离株全基因组测序及其致病性研究

为明确一株I群C亚群鸡腺病毒血清4型(FAdV-4)AHHN分离株基因组特征及其致病性,本研究对该病毒的全基因组序列进行测定,结果显示:AHHN分离株的基因组全长为43723bp,G+C含量为54.87%,ORF29序列具有FAdV-4变异株29aa缺失的特征。0.1mL/羽(1×10^5TCID50)病毒量肌肉注射3周龄SPF鸡2d后,感染鸡出现急性感染症状,5d内全部死亡;剖检可见其肝脏变黄,表面大量出血灶,伴有心包积液、胸腺萎缩、法氏囊萎缩等眼观病变;病理组织学观察显示,感染鸡肝脏呈现典型的嗜碱性包涵体肝炎病变;病毒载量测定结果显示,各脏器均有不同程度的病毒复制。上述结果表明,FAdV-4AHHN分离株对鸡具有高致病性及广泛的组织嗜性。本研究为进一步研究FAdV-4功能基因对病毒毒力的影响奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。     

鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒单链抗体文库构建及筛选

为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体。本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力。结果成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×10~(10) PFU/mL,通过4轮吸附-洗脱-富集筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体。该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。