文冠果转录组SSR特征分析及EST-SSR标记开发

【目的】利用高通量测序技术分析文冠果转录组中SSR位点分布类型与特征,并设计开发EST-SSR标记,为文冠果的遗传多样性分析提供标记资源。【方法】利用MISA软件筛选文冠果51 867条unigenes中的SSR(2~6bp)位点,统计分析SSR位点的分布特征、发生频率和平均分布距离。利用Prime 3在线软件随机设计合成60对EST-SSR标记,用我国7个省份的16份文冠果材料对所设计的标记进行多态性筛选;用Popgene 32软件分析标记的等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)和多态性信息含量(PIC)等。【结果】从文冠果unigenes中筛选出6 707个SSR位点,其平均发生频率为12.93%,平均分布距离5.38kb,平均长度17.30bp,其中2、3核苷酸重复单元的发生频率分别为6.24%和4.93%。设计的60对标记中有47对能扩增出与目的片段长短相符的产物,其中14对多态性较高,共扩增到52个等位基因,HO和HE分别为0~0.813和0.353~0.762,PIC为0.283~0.701。【结论】文冠果转录组SSR重复单元以2、3核苷酸重复为主;新开发的14个EST-SSR标记可作为文冠果种质资源多样性分析的标记资源。     

基于转录组序列的叶用芥菜奶奶青菜EST-SSR标记开发与遗传多样性分析

为了探究叶用芥菜奶奶青菜资源的多样性水平,基于转录组数据研究了奶奶青菜简单重复序列标记(EST-SSR)特征,筛选了适合奶奶青菜的EST-SSR引物,并分析了奶奶青菜的遗传多样性。转录组测序分析共获得46 386条非冗余基因(unigene),其中13 544条unigene序列中含有18 720个简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)位点,SSR的发生频率为29.20%,平均每2.73 kb出现1个SSR,分布频率为40.36%。优势重复序列为单核苷酸,占总SSR数量的49.39%,其次为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR数量的25.44%和24.13%。AT、AGCT和AAG/CTT分别是单核苷酸、二核苷酸以及三核苷酸的优势重复基元。以30份奶奶青菜和5份其他芸薹属蔬菜为材料,从37对引物中筛选出17对多态性引物,扩增得到135条多态性条带,多态性比例达88.2%。遗传多样性分析结果显示,平均等位基因数(N_a)为5.705 9,平均有效等位基因数(N_e)为2.397 8,平均多样性指数(I)为1.036 1,平均观察杂合度(H_o)为0.312 1,平均期望杂合度(H_e)为0.530 0,平均Nei’s期望杂合度为0.521 9,表明筛选出的17对SSR引物具有较好的遗传多样性。通过非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚类分析,在相似系数为0.677处可将30份叶用芥菜奶奶青菜材料分为3类。试验结果可为叶用芥菜奶奶青菜的种质资源鉴定、亲缘关系分析和分子标记辅助育种等研究提供引物支持和技术参考。     

基于转录组序列的芜菁SSR标记开发及应用

为了研究芜菁(Brassica rapa L.)种质资源的多样性水平，本研究采用转录组测序的方法挖掘芜菁的SSR分子标记。结果表明：转录组测序分析共获得了253 720条unigene,其中13 247条unigene序列中含有2个或2个以上SSR位点，SSR的发生频率为25.05%,平均每3.15 kb出现1个SSR,分布频率为31.42%。30对引物最终均获得了多态性高、条带清晰的结果，共扩增出多态性条带有126条，平均每对引物扩增出4.2条，平均多态率100%。根据电泳检测扩增结果，最终得到24对多态性高、条带清晰的芜菁SSR引物，24对SSR引物在50份芜菁材料中共扩增获得了101个等位基因，平均每个位点等位基因数4.21个，分析显示，平均有效等位基因数(Ne)为1.481 7个，有效等位变异率为35.19%,这些结果表明，筛选出的引物能较好地表现50份芜菁的遗传多样性，同时对于更多芜菁品种的DNA指纹图谱构建和杂交种鉴定均具有重要意义。     

基于干旱胁迫下杉木转录组序列的EST-SSR分子标记开发

利用干旱胁迫下杉木转录组数据进行杉木EST-SSR分子标记的开发。对干旱胁迫下的杉木组培材料在Solexa mRNA-Seq平台的二代高通量测序技术下进行了转录组测定,序列拼接后共得到75 357个片段,总长度65.29 Mb,共含有EST-SSR位点2 383个,其中三核苷酸重复类型数量最多,占总数的41.21%。随机挑选120个EST-SSR,用Primer Premier 5软件设计引物,再以遗传距离较远的8份杉木DNA样品为模板,通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从120对引物中初选出电泳条带较好的24对引物,用24份杉木DNA样品进行毛细管电泳检测。结果表明:在初选出的24对EST-SSR引物中有23对引物检测出特异性峰;在24份杉木样品中共检测到等位基因94个,平均每个位点4.087 0个,等位基因变异数范围2~9个;有效等位基因数范围1.086 8~6.914 3个,平均有效等位基因2.089 0个;观测杂合度范围0.250 0~1.000 0;期望杂合度范围0.082 4~0.896 1;多态性信息指数范围0.173 2~2.035 3。开发得到的一组杉木EST-SSR分子标记为研究杉木的遗传多样性、种群结构、DNA指纹数据库构建和遗传信息的保存提供了基础。     

基于转录组测序的花椒属物种EST-SSR标记开发

【目的】开发适用于花椒(Zanthoxylum bungeanum)和竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)的EST-SSR引物,为花椒属物种的鉴定及遗传多样性探究提供分子标记。【方法】对花椒和竹叶花椒分别进行转录组测序(RNA-seq),基于得到的EST序列开发SSR引物。在2种花椒的EST-SSR引物中分别随机挑选60对引物,用12份材料(4份花椒和8份竹叶花椒)为样本,利用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性。从有特异性条带的引物中,再随机选取花椒和竹叶花椒SSR引物各15对,选取6个(2份花椒和4份竹叶花椒)样本,利用聚丙烯酰胺银染电泳进行多态性检测。【结果】花椒共有64 944条Unigene,碱基对长度共54 073 890bp,含有12 746个SSR位点,分布在10 595条Unigene上,SSR位点出现频率为19.63%,平均分布距离4.24kb。竹叶花椒Unigene共75 669条,碱基对长度58 975 053bp,共15 096个SSR位点,分布在12 612条Unigene上。SSR位点出现频率为19.95%,平均分布距离为3.91kb。60对花椒引物中,有46对成功扩增出特异性条带,扩增效率76.67%;60对竹叶花椒引物中,有41对扩增出特异性条带,扩增效率68.33%。花椒和竹叶花椒的特异性条带大小在100～300bp,主要集中在150～250bp。多态性验证试验中,15对花椒引物中有12对产生了多态性条带,多态率80.00%;15对竹叶花椒引物中则有14对产生了多态性条带,多态率93.33%。【结论】基于花椒和竹叶花椒转录组高通量测序结果开发的EST-SSR分子标记引物,具有较明显的特异性和多态性。     

亚麻EST-SSR标记开发

为了进一步开发利用现有亚麻EST-SSR资源,从NCBI公共数据库下载7 947条亚麻EST,去除低质量和冗余序列后,筛选得到含有SSR的序列共239条,检出率为3.0%。其中二核苷酸重复49条,共7个重复类型;三核苷酸重复160条,共41个重复类型;四核苷酸重复30条,共11个重复类型。根据不同的重复类型共设计65对EST-SSR引物,在20份材料PCR扩增检测结果表明,有52对引物有目的扩增产物,其中32对扩增条带清晰且具有多态性,占设计引物的49.2%,通过聚类分析可将20份亚麻材料划分为五大类,验证了EST-SSR分子标记在亚麻遗传多样性分析中应用的可行性。     

兰属植物EST-SSR标记开发及应用

本研究利用兰属植物杂交种转录组测序数据开发EST-SSR标记,分析标记的多态性及兰属种质的遗传多样性,为兰属植物种质资源的创新和分类研究提供参考。结果表明,转录组测序分析获得113 780条Unigene,从中共识别到23 709个SSR位点,SSR位点出现频率为20.84%。从设计的200对引物中筛选出20对具有多态性,并且扩增条带大小与预期相符的EST-SSR标记引物,对48份兰属种质材料进行PCR扩增,平均多态位点数为3.0,共检测到81.00个等位基因,平均每对引物检测到4.05个等位基因。观测杂合度平均值为0.320 8,期望杂合度平均值为0.507 0;Shannon’s信息指数的变化范围为0.233 8～1.472 4,平均值为0.932 1,多态信息含量为0.110 3～0.662 2。对4个参试兰属植物种群进行遗传多样性分析,春兰和大花蕙兰的F_1杂交种群与大花蕙兰种群亲缘关系较近,与春兰种群的亲缘关系较远。聚类分析结果表明,遗传相似系数为0.72时,48份种质聚成7类,春兰和大花蕙兰的F_1代杂交种群大多聚入第I类,春兰种群聚入第V类,第II类、第III类、第IV类、第VII类均为大花蕙兰种群。     

贵紫麦1号转录组EST-SSR标记发掘与应用

为了开发新的小麦分子标记,利用前期小麦品种贵紫麦1号的转录组测序结果,对所得序列进行EST-SSR(Expressed sequence tags-simple sequence repeat)标记开发,并对开发的标记进行了染色体定位、多态性筛选。结果表明,在119 572条总Unigenes序列中得到8 749条含SSR位点的EST序列,占7.3%,平均每8.04 kb就会出现1个SSR;EST序列中SSR类型的分布特点为三核苷酸重复类型最多,而五、六核苷酸重复类型出现频次很少,单核苷酸重复以A/T出现频次最多,二核苷酸重复以AG/CT出现频次最多,三核苷酸重复以CCG/CGG出现频次最多;对含SSR位点的EST序列进行引物设计,成功设计出引物的序列有5 503条,占总EST序列的62.9%,从中筛选到341对有效性EST-SSR引物;以中国春为对照,利用16份中国春缺体-四体系材料对341对EST-SSR引物进行染色体定位,共定位153对引物、201个位点,涉及除3A、5A、3B、4B及1D外的16条染色体,其中5B染色体定位引物对最多,达23对;筛选出53对多态性EST-SSR引物,对52份小麦材料进行遗传多样性分析发现,其中18对EST-SSR引物可将52份小麦材料一一区分。     

基于转录组数据的芦笋EST-SSR标记的开发及通用性分析

【目的】明确芦笋转录组中SSR位点的分布规律，开发高信息量的EST-SSR标记并分析通用性，为天门冬属植物系统进化分析、功能基因挖掘及分子标记辅助育种提供工具。【方法】以笔者课题组前期获得的15个芦笋根系RNA-seq数据为基础，采用MISA软件检索SSR位点、Primer 3.0软件批量设计引物及TB-tools软件批量e-PCR与Primer-blast程序逐一e-PCR相结合的方法剔除非有效引物。通过与基因组序列比对，获取标记所属基因ID、物理位置、潜在功能等信息。随机合成引物50对，以9份芦笋、7份天门冬、5份文竹和3份蓬莱松种质为材料，检测引物有效性、多态性和通用性。【结果】共检索出SSR位点36 590个，分布于30 229条Unigene，发生频率为4.78%，平均间距为9.17 kb。SSR位点非均匀分布于10条染色体，7号染色体数量最多（4 642个），3号染色体密度最高（37.86 SSR/Mb）。SRR位点从单核苷酸至六核苷酸均有分布，以三核苷酸（46.92%）类型最丰富，AG/CT(16.58%)基序最具优势。成功设计EST-SSR引物19 695对，经e-PC...     

基于海甘蓝RNA-Seq序列开发EST-SSR分子标记

利用油料作物海甘蓝(十字花科)发育时期种子的RNA-Seq测序数据组装获得186 778条cDNA重叠群(Contigs)序列,通过MISA和Primer 3程序设计了6 639个EST-SSR分子标记。在这些标记中,除了单核苷酸重复(45%)外,三核苷酸重复的SSR是最常见的碱基重复类型(29%),其次是双核苷酸型(10%)、五核苷酸型(7%)、六核苷酸型(5%)和四核苷酸型(2%)型。采用电子定位的方法将1 206个EST-SSR标记定位到近缘种白菜(Brassica napa)的基因组上。依据引物在白菜基因组中的分布,挑选了20条EST-SSR引物在海甘蓝中进行PCR验证,其结果显示所有引物均能够扩增出符合预期大小的PCR片段。这些新开发的EST-SSR引物可以作为功能标记应用于海甘蓝的分类鉴定、遗传图谱构建、种质资源鉴定以及分子标记辅助育种工作中。     

基于转录组测序的黄麻SSR分子标记开发与初步验证

为开发黄麻SSR引物,为黄麻分子标记辅助育种等研究提供有利工具,在黄麻转录组测序的基础上,采用MicroSAtellite(MISA)软件进行SSRs搜索,并对部分SSR引物的多态性进行验证,结果表明:1)在1kb以上的13 718条unigene中,共检测到8 571个SSR位点,占评估序列数目的62.47%,平均每3.47kb有1个SSR;2)所开发的SSR标记中,单核苷酸重复序列最多,占42.15%,二核苷酸和三核苷酸序列也较丰富,分别占14.80%和16.74%;3)利用Primer3.0软件设计了与木质素合成酶基因及MYB转录因子相关的880对引物,随机选取29对引物,以8份不同类型黄麻种质进行多态性验证,获得8对具有稳定多态性的引物,多态性引物比率为27.58%。结果表明,基于黄麻转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的SSR标记可为黄麻属遗传多样性分析、遗传图谱构建及功能基因的挖掘等研究提供有利工具。     

基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes,利用MISA软件进行搜索,得出简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)的分布情况,共挖掘检索得到1 886个SSR位点,SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上,发生频率为3.05%,平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点,含有复合型SSR的Unigenes数目为56条,其中三核苷酸基元类型分布最多,SSR数量为1 582个,占挖掘出总SSR数量的83.88%,而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计,得到部分引物序列,可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。     

基于EST-SSR分子标记的萱草亲缘关系分析

萱草是极具观赏价值的多年生宿根草本植物,在我国具有悠久的栽种历史。为了探明36个萱草品种间的亲缘关系,利用毛细管电泳荧光标记技术对36个萱草品种进行了EST-SSR分子标记检测,利用11对多态性良好的引物对36份供试萱草材料进行PCR扩增。结果显示：11对引物共获得40个多态性位点,样本平均有效等位基因数为2.58个,平均Shannon多样性指数为1.00,平均期望杂合度为0.57,平均观察杂合度为0.52;以遗传距离矩阵为分析对象,36个萱草品种间的遗传距离为0.05～0.70,利用NTSYS软件按UPGMA法聚类结果显示,遗传距离0.48为阈值时,36种萱草品种分为2个大类,遗传距离0.414为阈值时,可进一步将第1大类分为4个亚类。综上,供试的36个萱草品种之间具有较高的遗传多样性和较为丰富的遗传背景,为今后培养萱草优良新品种提供了一定的理论依据。     

EST-SSR标记应用于麦冬类植物遗传多样性研究

为研究麦冬类植物材料的遗传多样性,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,用8对EST-SSR引物在32份麦冬类植物材料进行扩增检测,并对样本进行聚类分析。结果表明:8对引物的PIC(Polymorphic information content)位于0~0.869,平均值0.567,引物1扩增出最多的等位基因数,占总值的20.41%;遗传距离矩阵研究发现,个体1和个体23间的遗传距离最大为2.48,说明二者遗传分化程度最大,个体18和个体23地理来源虽然不同,但二者间遗传距离最小,表明二者间有一定程度的基因交流现象;同时,居群c(野生杭麦冬)内的平均遗传距离最小为0.03,居群d(阔叶山麦冬)内的平均遗传距离最大为0.93。在聚类分析中,32份材料被分为2大类,在主坐标分析中,32份材料被分为3大类,2种分析结果具有相似性。研究表明EST-SSR标记可以很好地对麦冬类植物材料进行划分。     

半夏SSR分子标记开发与遗传多样性

对半夏转录组数据进行分析,设计开发SSR引物,利用筛选出的SSR引物分析不同居群间半夏的遗传多样性,为半夏分子标记辅助育种提供支撑。结果显示:筛选出的19对多态性较高的引物在17个半夏居群中共检测到49个多态性位点,具有较高的多态性;利用UPGMA作图共将17个半夏居群分为3个类群;通过分子方差分析(AMOVA)发现半夏居群内的变异达到88%,说明群体与群体间的差异相对较小,遗传变异主要来源于个体间;居群间平均分化系数Fst为0.124,居群间基因流Nm值为1.765,表明居群间能正常地进行基因交流,且居群间遗传分化受基因流的影响较大。本研究利用SSR技术开发的19对SSR引物在不同半夏居群间具有一定的通用性、多态性,能将17份半夏材料明确区分。     

用EST-SSR标记评价21份黄瓜种质的遗传多样性

采用15对EST-SSR引物对21份不同生态类型(华北型、华南型、欧洲温室型和野生种)的黄瓜种质进行了分析,共检测到65个等位基因,平均4.33个,多态性信息量(PIC)值变幅0.177 ～0.748,平均值为0.470,表明12对引物具有高度或中度多态性.NTSYS软件聚类分析表明,21份黄瓜种质可分为2大类,外来种...     

利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记

【目的】利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记,为甘蔗建立一种高效和低成本的分子标记开发方法。【方法】以40个甘蔗栽培品种为试验材料,使用高通量测序平台获得其转录组数据,经质控后将其匹配到参考基因组,然后使用GATK软件检测和过滤SNP分子标记,并使用snpEff对SNP进行注释及统计分析。利用这些SNP分子标记进行系统发生分析、主成分分析和群体结构分析。最后,开发KASP标记并随机验证其有效性。【结果】转录组数据经质控后平均每个样本获得6.5 Gb的序列。通过变异分析和多重过滤筛选后,共获得220397个注释到染色体上的双等位基因SNP位点,平均密度为3 SNP/kb。SNP类型及分布特征分析结果表明,编码区错义突变与沉默突变的比值（N/S）为1.05,转换类型和颠换类型的比值（Ts/Tv）为1.89,杂合SNP占38.66%～49.91%,位于转录本的SNP比例为44.74%。系统发生分析、主成分分析和群体结构分析结果均表明,甘蔗栽培品种遗传来源较为单一,但群体分化较大。开发了11176个KASP分子标记,并随机合成25组KASP引物进行多态性验证,共有23组（92%）引物能检测到扩...     

基于EST-SSR标记的陕西茶树种质资源遗传多样性研究

【目的】明确陕西省茶树种质资源的遗传多样性,为茶树育种提供依据。【方法】以陕西地方和野生种质资源、陕西临近省份以及西南茶区共8个省份的118份茶树资源为材料,利用43对高质量EST-SSR引物,用PROSize 2.0软件统计扩增条带,用Powermarker V3.25分析软件计算主等位基因频率（MAF）、基因型、等位基因数（N_a）、观测杂合度（Ho）、Nei基因多样性指数（H）和多态信息含量（PIC）,用MEGA 6软件进行UPGMA聚类分析,对陕西茶树资源的遗传多样性进行分析。【结果】从118份茶树材料中共检测到310个等位基因和832个基因型。主等位基因频率（MAF）、每个位点等位基因数（N_a）、扩增基因型和多态信息含量（PIC）的平均值分别为0.336 8,7.21个,19.35和0.727 2。Nei基因多样性指数（H）在0.232 3～0.911 0,平均值为0.760 0;观察到的杂合度（Ho）在0.105 7～0.991 8,平均值为0.811 2。聚类分析结果将陕西省茶树种质资源分为3大类群,同一地区的陕西茶树资源多聚在一起;对不同地区茶树资源的聚类结果表明,陕西省茶树资源聚为一支,且与湖北的茶树资源关系较近。【结论】陕西省茶树资源具有丰富的遗传多样性和相对独立的遗传背景,且与湖北省茶树资源遗传关系较近。     

花椰菜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

【目的】开发适合花椰菜的SSR分子标记,为花椰菜品种遗传关系鉴定、遗传图谱绘制等提供候选标记。【方法】以24份花椰菜材料为研究对象,通过MISA软件对其转录组SSR位点信息进行分析,设计SSR引物,对这些引物进行PCR扩增,开发高多态性花椰菜的SSR分子标记;利用差异条带对不同花椰菜材料的亲缘关系进行分析。【结果】从转录组数据中得到66 450条Unigene基因,包含10 715个SSR位点,发生频率为12.09%,平均分布距离为5.9kb。SSR位点中优势类型为二核苷酸重复基序,出现频率占总SSR的51.16%;其次是三核苷酸,占总SSR的47.37%。重复序列基序共49种,其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和AAG/CTT。有1 164个长度≥20bp的SSR位点,获得具有潜在高多态性的SSR引物6 119对。随机设计的40对引物中有31对引物能进行有效扩增,其中有17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示,在遗传距离为0.625时,17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。【结论】开发的花椰菜SSR标记类型丰富,出现频率高,具有较高的可用性。