制备免疫吸附电镜检测甘薯羽状斑驳病毒样品

 甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)可经蚜虫、摩擦、嫁接方式传播,是Y病毒组的一个成员。受此病毒感染的甘薯叶片上形成羽状褪绿斑,脉间褪绿斑点以及紫色环斑,有的品种出现紫色条纹。在甘薯块根上,有的呈严重纵向褐色龟裂,有的呈横向螺纹状木质化,有的块根内部形成木栓化,是危害甘薯最严重的病毒病害,可使甘薯严重退化及减产。无论是甘薯的抗病毒育种、病毒病害的防治,还是脱毒、无病毒甘薯种薯生产都离不开病毒的检测。灵敏的免疫吸附电镜(ISEM)检测方法被应用于各种病毒的检测中。     

甘薯病毒病的研究Ⅰ甘薯羽状斑驳病毒的分离、鉴定

 本文从寄主范旧,蚜传特性、病毒颗粒形态、免疫电镜等方面对嫁接获得的甘薯羽状斑驳病毒廊坊分离物(SPFMV-LF)进行了鉴定,并和SPFMV-RC(美国株)进行了实验比较。SPFMV-LF易汁液摩擦传播和嫁接传播,并以蚜虫非持久性传播,SPFMV-LF系统侵染巴西牵牛(Ipomoea setosa)、牵牛(I.nil);不侵染Chenopodium quinoa、C.ama-ranticolor、Nicotiana benthamiana及其它烟草。尚未发现其局部斑寄主。SPFMV-LF及SPFMV-RC感染I.setosa后引起相似的症状,但感染I.nil后症状差别较大。病毒颗粒长860-830nm,经两次蔗糖垫超速离心从SPFMV-LF感染的I.setosa叶片提取病毒并在BALB/C小鼠中制备抗SPFMV-LF的腹水多克隆抗体,免疫电镜表明,SPFMV-LF的抗体和SPFMV-RC株系有反应。上述实验结果表明SPFMV-LE是SPFMV的一个株系,但不同于SPFMV-RC。     

甘薯羽状斑驳病毒的分离与提纯

 本文应用标准的甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)抗血清,通过两次蚜传,从徐薯-18、新大紫上得到一种病毒分离物。接种指示植物后这种分离物仅感染Ipomoea setosa、Ipomoea nil,不侵染Gomphrena globosa L.、Beta vulgaris L.、Nicotiana tabacum L.、Nicotiana glutionsa L.、Brassica pekinensis, Datura stramonium L.、Cucumis sativis L.、Brassica、juncea、Raphanus sativus、Phsalis floridana。此病毒分离物可用蚜传、摩擦接种、嫁接三种方式传播,稀释限点为10-5,体外存活期不到24小时,热灭活温度为60~65℃。蚜传这种分离物到 I.Setosa上,再嫁接到I. nil或I. setosa上扩大增殖,用0.2M pH7.2 PB^K进行粗提取,结合垫层超离心,最后经蔗糖密度梯度离心得到了高纯度的病毒的提纯物,OD260/280的比值为1.25,粒体长度主要集中在830~850nm之间。实验证明这种病毒分离物为甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)。病毒收量为64.3mg/kg感病组织。提纯病毒在电镜下任何视野都可见到多量的、密集成堆的病毒粒体。     

甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备

 甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT-PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,cp基因全长900 bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物cp基因的核苷酸序列一致性为78.3%～89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%～95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物CP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,cp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFV CP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1∶128 000,可用于田间甘薯样品的检测。     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3'端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

香石竹斑驳病毒( CarMV) 主要基因的分子变异分析

 香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus, CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一。本试验从12 个香石竹品种中获得CarMV 分离物,通过RT-PCR 扩增包含p7、p9、CP 3 个主要基因的片段,并对扩增产物进行克隆测序。通过序列比对发现CarMV 的p7、p9、CP 3 个基因有较高的稳定性,p7 基因核苷酸序列相似性为98. 10% ,氨基酸序列相似性为97. 81% ,其中氨基酸的第11 和14 位存在显著差异;p9 基因核苷酸序列的相似性为98. 80% ,氨基酸序列相似性为99. 13% ,氨基酸序列在第4 差异明显;CP 基因核酸序列相似性为97. 58% ,氨基酸的相似性为98. 43% ,氨基酸序列的第164 和331 位的变异存在相关性,整个CP 变异位点比较分散。证实p7 和p9 的变异位点主要集中在暴露与寄主互作相关的N 端,推测这是导致病毒变异,与寄主互作变异的重要位点。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒山西西瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

通过病毒dsRNA分离技术、非序列依赖性PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)技术和RTPCR等手段对采自山西太谷的西瓜病样进行了检测与鉴定,确定其为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)所侵染。为明确CGMMV西瓜分离物(CGMMV-SXTG)的分类地位,本研究进一步克隆了CGMMV-SXTG的外壳蛋白基因(coat protein,CP)全序列并进行序列分析,系统进化树分析显示该分离物与亚洲分离物亲缘关系较近,而与欧洲分离物亲缘关系较远,表明该病毒的不同分离物在分组上可能与地域有一定的关系;接着对不同分离物的CP基因核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对分析,结果表明该分离物与中国山东分离物(TANG)同源性最高,分别达到99.8%和99.6%。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白大小亚基的原核表达及其抗血清制备

本研究对菜豆荚斑驳病毒大、小亚基编码的基因密码子进行了优化并人工合成了这两个基因,然后克隆到原核表达载体p ET-22b(+)中,通过转化大肠杆菌BL21(DE3)菌种并在IPTG的诱导下进行了成功表达,大亚基表达产物分子量为41 k D、小亚基表达产物分子量为22 k D,并制备出了大小亚基基因表达产物的抗血清。测试结果表明,优化后的CP的大、小亚基基因在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下,3 h后得到了成功的表达,制备的两种抗血清特异性强、效价都达到1∶3.2×10~4,可以对BPMV CP 3个不同的区域同时进行检测,提高了检测的准确度。     

甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单-RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法.该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型.灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL.该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具.     

我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害

甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease,SPVD)是由毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)和马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害[1].     

甘薯脉花叶病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus,SPVMV)外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPVMV河南分离物（SPVMV-HN）基因组3′端1.8 kb的基因片段,包括部分NIb 基因序列和完整的CP基因及3′端非编码区序列(3′UTR)。序列分析表明,SPVMV-HN的CP基因由996个核苷酸组成（GenBank登录号为FJ687211）,编码332个氨基酸残基。与已发表的SPVMV其他分离物相比,其推导的氨基酸序列一致性为95.2%～98.5%,与 SPVMV广东分离物的氨基酸序列一致性为97.9%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPVMV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。利用SPVMV的抗血清,对采自全国14个省（市）的田间甘薯样品以及嫁接的巴西牵牛样品进行了检测,结果表明,SPVMV在我国甘薯上普遍存在。     

南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析

以来自甘肃的南瓜果实样品中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，序列测定和分析结果表明：扩增片段包含CGMMV的外壳蛋白基因和3’非编码区，证明南瓜果实中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒，将其印基因序列与来自国内不同地区的其他CGMMV分离物进行序列比对，发现国内各分离物间的同源率高，有很近的亲缘关系。     

基于外壳蛋白基因序列对3种葫芦科作物病毒的分子分析

 从山西运城的南瓜(Cucurbita moschata)、河南开封和孟津的西葫芦(Cucurbita pepo)上通过ELISA分别检测到南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus-Watermelon type,PRSV.w),通过接种分离纯化获得其病毒毒原(CH99/211,CH99/113,CH99/69)。本研究克隆了这3个分离物的外壳蛋白基因,应用DNAStar、Clustal X、Phylip等分析软件将这些序列同已报道的相应序列进行分析并构建系统树。结果发现SqMV可以分为两个组,CH99/211分离物与美国的Arizona分离物接近,应属于z组;WMV分为两个组,CH99/69同国内黑龙江分离物(WMV-HLJ)和云南分离物(WMV-CHN)最接近,成一小簇;PRSV分成两个组。CH99/113属于Ⅱ组,与国内SP、MZ和BN分离物接近。序列分析表明PRSV和WMV在进化上具有地理相关性。SqMV和PRSV-W外壳蛋白基因序列分析属国内首次报道。     

Molecular evidence that a lily-infecting strain of Tulip breaking virus from Japan is a strain of Lily mottle virus

The sequence of the 3-terminal 2074 nucleotides (nts), excluding the 3-poly (A) tail, of RNA of a potyvirus isolated from lily (Lilium Asiatic hybrid cv. Enchantment) in Japan, currently tentatively designated as Tulip breaking virus-li (TBV-li), was determined. The sequence started within a single open reading frame (ORF) that encoded the carboxyl terminus of the large nuclear inclusion protein (NIb) and the complete 275-amino-acid coat protein (CP), followed by a 3-untranslated region (3-UTR) of 204 nts. The CP of TBV-li shared 91% amino acid (aa) sequence identity with that of TBV lily strain Dutch isolate (TBV-lily). The nt sequences of their 3-UTR were 94% identical. However both viruses shared only 60–65% sequence identities with TBV tulip strain Niigata isolate in the corresponding regions. The results suggest that TBV-li is closely related to TBV-lily, and that these two TBV lily strains should be classified into a species different from TBV tulip strains. We therefore support a proposal to rename TBV-lily Lily mottle virus (LMoV), and suggest that TBV-li is another strain of LMoV (LMoV-J).     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

一个马铃薯X病毒分离物的外壳蛋白基因序列分析与株系鉴定

对山东省侵染马铃薯的一个马铃薯X病毒(PVX)分离物PVX—SD1的外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和序列分析。以提纯的病毒RNA为模板，应用RT-PCR扩增目的基因，通过常规的基因克隆法将扩增的CP基因导入pUC19载体，测序。结果表明，PVX—SD1的CP基因长719bp，可编码248个氨基酸；与Gen—Bank中报道的15个有代表性的株系或分离物相比较，核苷酸同源性在80．1％-99．7％，氨基酸同源性在89．8％-100％；与欧洲株系UK3仅1个核苷酸不同，同源性为99．7％，氨基酸同源性达100％，表明它们可能为同一株系，属于X^3组．