柞蚕脂肪体RNA量的消长与体液卵黄原蛋白含量的关系

测定了柞蚕吐丝当日至化蛹第 1日不同日龄雌体脂肪体和吐丝期第 5日雄体RNA的含量。雌体RNA的含量随发育日龄的增加而增加 ,吐丝第 5日达到高峰 ,脂肪体RNA的含量为 2 4 1μg/mg,化蛹当日脂肪体RNA的含量开始下降。雄体中的RNA含量甚少。柞蚕体液SDS PAGE分析结果 ,吐丝当日已出现卵黄原蛋白 ,随日龄的增加而增加 ,第 5日达到高峰 ,化蛹当日有所下降 ,这与测定的脂肪体中RNA的变化趋势是一致的。Northern印迹分析的结果表明柞蚕雄体中的RNA并非是卵黄原蛋白mRNA ,卵黄原蛋白的表达具有时期特异性和性特异性。证明了柞蚕卵黄原蛋白的合成与家蚕和惜古比天蚕一样 ,从吐丝期到蛹初期的脂肪体卵黄原蛋白mRNA的增加和体液中卵黄原蛋白量的增加的时期一致。     

柞蚕卵黄磷蛋白的鉴定、纯化及其在卵形成和胚胎发育中的变化

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换纤维素柱层析和薄层扫描等方法鉴定、纯化了柞蚕卵黄磷蛋白,并考察了该蛋白质在卵形成和胚胎发育期间的变化.结果表明:(1)发育卵巢和成熟卵内存在着一种卵黄磷蛋白(Vtn),其前体是雌蛹血淋巴内的卵黄原蛋白(Vg),该蛋白质具有雌特异性.(2)Chino等的方法也适用于以柞蚕卵为材料纯化Vtn,初步纯化的Vtn亚单位分子量是200KDa.(3)后蛹期,发育卵巢中可溶性总蛋白和Vtn的相对百分含量都迅速上升,至卵粒成熟期达最大值.(4)胚胎发育前期,卵可溶性总蛋白和Vtn的相对百分含量基本维持原水平;胚胎发育后期,二者都急剧地减少;孵化时卵可溶性总蛋白含量和Vtn的相对含量分别降至刚产下时的50%和10%以下.     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA 3'端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias selene Hubner)是野生泌丝昆虫.从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA 3'端进行RACE(rapid ampliftcation of eDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An.theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、家蚕(Bombyx mori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%.同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性.     

柞蚕蛹溶菌酶的诱导与提取

本文报道热空气、大肠杆菌K_(12)D_(31)诱导柞蚕蛹(Antheraea pernyi)血淋巴溶菌酶活力提高的最适条件以及从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.以Sephadex G-50和CM-Sepharose柱层析法从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶,并首次获得柞蚕蛹溶菌酶结晶,溶菌酶制剂比活力达到57353单位/mg蛋白,提高了257倍,总活力回收79.2%.首次应用选择性热变性,等电点沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、包被甲壳素-纤维素亲和层析等分离技术从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.溶菌酸制剂比活力达25 375单位/mg蛋白,提高了140倍,活力回收51%.用15%、pH4.0聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和3.0-100%.pH6.7-8.9SDS-PAGE鉴定了酶制剂的纯度,并测定了柞蚕蛹溶菌酶的部分氨基酸组成.     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA3′端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias seleneHbner)是野生泌丝昆虫。从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA3′端进行RACE(rapid amplification ofcDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An-theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、家蚕(Bombyxmori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性。     

柞蚕5龄幼虫血淋巴中蛋白质和糖类物质的动态变化

为探讨柞蚕壮蚕期体内物质代谢对滞育生理的影响,研究了不同蚕季的柞蚕5龄幼虫血淋巴中蛋白质和糖类物质含量的动态变化。结果表明:春、秋期柞蚕5龄幼虫血淋巴中总糖、海藻糖和蛋白质含量均随着生长发育而增加,总糖和海藻糖在5龄末期稍有下降;秋期柞蚕血淋巴中的总糖含量略高于春期柞蚕,海藻糖含量二者大致相似,而蛋白质含量却高于春期柞蚕,并且显示出特征蛋白质谱带。推测秋蚕期柞蚕体内物质的变化与发生滞育有关。     

蜜蜂卵黄原蛋白

卵黄原蛋白，同大多数生物化学成分一样，在蜜蜂的生理学方面具有多种功能。卵黄原蛋白是卵生雌性动物特有的一种糖酯蛋白的前体，由腹部脂肪体细胞合成，含有糖醇（乙二醇），脂类或脂肪和氨基酸；对于蜜蜂，这些成分的含量分别是2％、7％和9％。卵黄原蛋白的合成是受保幼激素调控的，在卵黄沉积之前直接合成分泌到血淋巴中，被血淋巴输送到卵巢，这些卵黄原蛋白只能被卵黄卵母细胞所识别，并通过微胞饮作用将其摄入形成卵黄磷蛋白。对于蜜蜂，卵黄原蛋白不仅在具有繁殖能力的蜂王体内合成，     

线虫寄生对柞蚕幼虫生长发育和营养物质代谢的影响

研究寄生线虫对柞蚕幼虫生长发育和营养物质代谢的影响,可以从生理生化角度揭示柞蚕寄生线虫的致病机制,明确线虫在柞蚕体内完成寄生生活史的生理生化调控机制。检测柞蚕5龄幼虫被线虫寄生后其生长发育速度、血淋巴营养物质含量和中肠蛋白酶活性,结果表明,柞蚕幼虫被线虫寄生6～11 d,其摄食量和体质量变化不明显,血淋巴总糖、海藻糖含量短暂性升高,随后便急剧下降,血淋巴蛋白质含量和酯酶活性升高,甘油酯含量降低,中肠蛋白酶活性极显著低于对照组;被寄生12～15 d,柞蚕摄食量升高、体质量增加,中肠蛋白酶活性升高,而血淋巴中总糖含量、海藻糖含量、海藻糖酶活性、甘油酯含量极显著低于对照组,说明此时是线虫迅速生长的时期,蚕体营养物质被线虫大量消耗;被寄生15 d后摄食量急剧下降,血淋巴中能源物质含量极显著降低,中肠蛋白酶活性极显著低于对照组。线虫寄生柞蚕幼虫后与寄主形成营养竞争关系,造成蚕体营养物质严重缺乏、消化能力减弱、生长发育迟缓。研究结果可为揭示线虫对柞蚕的致病机制以及利用索科线虫进行农林害虫的生物防治提供参考。     

柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕5龄雌雄个体血淋巴蛋白质含量和组成的变化及差异分析

以柞蚕5龄幼虫为材料添食柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi,Np),通过测定与分析不同性别5龄幼虫血淋巴蛋白质含量和组成变化的差异,为探究柞蚕对柞蚕微孢子虫感染的免疫应答提供依据。感染柞蚕微孢子虫的不同性别柞蚕5龄幼虫的血淋巴蛋白质含量随蚕体发育进程出现不同的变化:雌性个体与雄性个体分别在添食Np后24 h与48 h,血淋巴蛋白质含量极显著增加(P<0.01),且持续至添食后96 h,其中雌性个体的血淋巴蛋白质含量又极显著高于雄性个体(P<0.01);在添食Np后120 h,雌、雄个体的血淋巴蛋白质含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。SDS-PAGE分析表明,添食Np后的柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质组成与对照组基本一致,均显示出20条分子质量在20.1～97.2 kD的蛋白条带,其中雌、雄个体在添食后96 h,大小约44 kD的蛋白条带明显加深,大小约28 kD的蛋白条带雌性个体在添食后144 h、雄性个体在添食后120 h明显加深,且雄性个体在添食后120～168 h大小约42 kD的蛋白条带明显加深,但在添食后192 h与对照组无明显差异。研究结果说明Np侵染后,柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质的含量及组成均产生了一定的变化,并且雌雄个体间的变化存在差异。     

柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因Apserpin-6的克隆及功能分析

昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)可以通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性调控机体的免疫防御反应。依据柞蚕中肠转录组数据库中一段编码serpin的CDS序列设计正、反向引物,以柞蚕幼虫总c DNA为模板克隆得到一段全长1 239 bp的序列,经序列分析后命名为Apserpin-6(Gen Bank登录号:MF944108)。该基因编码412个氨基酸残基,其中N端第1~17位氨基酸为信号肽序列,在C端第357~391位氨基酸之间有一个反应中心环,第374~375位丝氨酸之间是预测的蛋白质裂解位点。半定量RT-PCR检测Apserpin-6在柞蚕5龄幼虫脂肪体中的表达量最高,在血淋巴和头部组织的表达量次之,在中肠、丝腺和马氏管中的表达量较低。荧光定量PCR检测在受到柞蚕肠球菌(Enterococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)以及柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus)侵染后的柞蚕幼虫血淋巴中,Apserpin-6的表达量均明显上升。利用在原核表达系统表达的重组Apserpin-6蛋白,对柞蚕幼虫血淋巴中的酚氧化酶原(pro PO)和酚氧化酶(PO)活性进行体外抑制试验,结果显示该重组蛋白能够抑制pro PO的活性,但对PO活性没有影响。试验结果提示,Apserpin-6可能作为一种负调控因子参与调控柞蚕血淋巴对于病原菌的免疫防御反应。     

VB_6对家蚕氮代谢的影响

用人工饲料无菌饲育方式 ,分析维生素B6(VB6)对家蚕丝腺生长、血淋巴蛋白质浓度、血淋巴游离氨基酸组成变化及氮代谢终产物尿酸形成的影响。结果表明 :5龄期家蚕在缺乏VB6条件下 ,丝腺生长严重受阻碍 ,血淋巴蛋白质不能正常合成 ,使体内氨基酸转化利用率下降 ,氮代谢终产物尿酸的排泄量增加 ,血淋巴中部分游离氨基酸浓度下降 ,特别是合成丝蛋白质主要成分的Ala、Ser和Tyr等蚕体非必需氨基酸的组成比率显著减少 ,而Gly、Orn和Cysta等的浓度增加异常 ,导致血淋巴中游离氨基酸组成动态平衡破坏 ,显示蚕体内因VB6缺乏引起氨基酸代谢失调。     

VB6对家蚕氮代谢的影响

用人工饲料无菌饲育方式，分析维生素B6（VB6）对家蚕丝腺生长、血淋巴蛋白质浓度、血淋巴游离氮基酸组成变化及氮代谢终产物尿酸形成的影响。结果表明：5龄期家蚕在缺乏VB6条件下，丝腺生长严重受阻碍，血淋巴蛋白质不能正常合成，使体内氨基酸转化利用率下降，氮代谢终产物尿酸的排泄量增加，血淋巴中部分游离氮基酸浓度下降，特别是合成丝蛋白质主要成分的Ala、Ser和Tyr等蚕体非必需氨基酸的组成比率显著减少，而Gly、Orn和Cysta等的浓度增加异常，导致血淋巴中游离氨基酸组成动态平衡破坏，显示蚕体内固VB6缺乏引起氨基酸谢代调。     

柞蚕抗菌肽对柑桔黄龙病及溃疡病病原菌的杀菌作用

首次报道柞蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａｐｅｒｎｙｉ）抗菌肽对柑桔黄龙病病原类细菌（ＢａｃｔｅｒｉａｌｌｉｋｅＯｒｇａｎｉｓｍ，ＢＬＯ）及溃疡病黄单胞菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰＶｃｉｔｒｉＤｙｅ）的杀菌作用，分别在平板培养基上用孔穴法注入５—１０μｌ免疫血淋巴，则出现明显的抑菌圈。用纯化的抗菌肽１０μｇ／ｍｌ处理ＢＬＯ及Ｘ．ｃｉｔｒｉ２０─６０ｍｉｎ，用电镜及激光共焦扫描显微镜观察到病原菌细胞膜的损坏、内容物泄出乃至死亡的过程，对抗菌肽的杀菌机理进行了讨论。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

分子标记技术在柞蚕育种中的应用价值

柞蚕育种是柞蚕研究的一个重要环节,相对于家蚕等其他物种来说,柞蚕育种技术相对落后。随着分子生物学的发展,分子标记技术不断完善,并应用到多个物种的育种工作中。简述了分子标记技术种类,原理,特点及研究成果,并比较几种常用标记方法,尝试从中找出更适合柞蚕的分子标记。介绍了分子标记技术的应用概况,对柞蚕分子标记技术的前景做出展望。     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。     

柞蚕微孢子虫单克隆抗体的研制及诊断

研究报告了柞蚕微孢子虫Nosemaantheraeae(简称N .a)单克隆抗体制备及免疫胶体金银染色法 (IGSS)诊断的结果。用抗N .a的单抗结合间接免疫胶体金银染色法 (IGSS)对 6种微孢子虫进行检测 ,在光学显微镜下柞蚕微孢子呈现特异的褐色 ,能与包括家蚕微孢子虫在内的其它 5种微孢子虫加以区别。     

农药氰戊菊酯和杀虫双诱导家蚕血液蛋白的变化

为了解析家蚕对常用农药氰戊菊酯和杀虫双的解毒机制,分别给家蚕5龄幼虫添食2种农药,观察家蚕对农药的中毒症状,采用双向电泳(2-DE)技术对添食农药的家蚕幼虫的血液蛋白进行分离,利用电喷雾电离(ESI)质谱对具有2次以上重复的显著差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学方法进行分析。家蚕5龄幼虫分别添食1/4LD50剂量浓度的2种农药后,均在3～12h内出现中毒症状,且血液蛋白的表达也发生了变化:在氰戊菊酯诱导下,幼虫血液中增加了纤维样蛋白、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂;在杀虫双诱导下,幼虫血液中增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂-13;经2种农药分别诱导处理后3h,幼虫血液中都减少了体液低分子蛋白-Ⅲ的表达。推测家蚕对氰戊菊酯和杀虫双具有一定的免疫反应。     

绢丝昆虫柳蚕的生物学特性和卵黄原蛋白鉴定

柳蚕 (ActiasseleneH櫣ｂｎｅｒ)是一种野生绢丝昆虫。通过室内饲养的方法 ,观察了柳蚕的生物学特性和卵孔的显微特征 ,在合肥地区的幼虫 4眠 5龄 ,二化性 ,蛹滞育 ,染色体n =31,全龄期达 4 0d以上。通过SDS PAGE和Westernblotting鉴定 ,柳蚕的卵黄原蛋白是由大小 2个亚基组成 ,分子量分别为 175kD和 4 5kD ,存在组织、时期、性别表达的差异性