日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶基因的表达及其免疫保护试验

为研究日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶（SjPP）的免疫功能，构建了原核表达重组质粒pET28a（＋）-SjPP，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）进行诱导表达，并用重组蛋白进行了小鼠免疫保护试验，免疫剂量为每次20μg／只，共免疫3次。结果表明，pET28a（＋）-siPP／BL21（DE3）在0．1mmol／L IPTG诱导2h时，每1g菌体可产生17．8mg以包涵体形式存在的重组蛋白；重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了高效价的血清特异性IgG抗体，并获得了部分减虫率、肝组织减卵率和显著的粪便减卵率，具有一定的免疫保护作用。     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

日本血吸虫Sj32KD抗原基因的克隆、表达及诊断应用

目的开展日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因研究,探讨其作为诊断抗原的潜力。方法应用PCR方法克隆Sj32KD抗原基因,并在大肠杆菌系统中进行表达,利用H is亲和层析方法纯化融合蛋白,并应用重组的Sj32KD抗原检测羊日本血吸虫病。结果克隆了ORF为1 272bP的日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因,成功构建表达质粒Sj32-pET28 a,并在BL21(DE3)菌株中获得了分子量为47KD的特异性表达产物。应用Sj32KD重组抗原应用于检测羊日本血吸虫病,结果阴性血清的特异性为85.71%,阳性血清的敏感性为95.45%。结论成功克隆表达了日本血吸虫Sj32KD抗原,原核表达融合蛋白有一定的诊断应用潜力。     

日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

为解析日本血吸虫精氨酸酶的功能,本研究克隆了SjARG基因、长度为1095 bp,并将该基因克隆一到原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET-28a-SjARG,并在大肠杆菌中成功表达,Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性;通过酶活性分析显示,重组蛋白SjARG在添加Mn2+后活性得到提高,酶活性大小为502 U/mg,Km值为82.7mM。该研究结果为进一步深入研究该基因的表达特性、酶学性质以及候选疫苗分子研究方面提供了基础。     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA片段的克隆表达及其免疫保护功能

本研究根据曼血吸虫抱雌沟蛋白（Gyncophoral canal protein)基因SmGCP保安区片设计－对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用TR－PCR法扩增出一大小为868bp的基因片段。测序后分析序列推断该片段与SgGCP相应片段碱基同源性86．6％。说明所克隆的基因为编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因,推断的氨基酸序列同源性为84．1％,将其克隆到表达载体pET28（a)中,在大肠杆菌BL21中获得了较高量的融合表达,表达产物分子量为29KD。利用因吸虫成虫粗抗原免疫大白兔所得抗血清对该表表达产物进行Westernblto检测,在预测位置出现了明显的识别条带,显示了该表达产物良好的抗原性。将该表达产物用佐剂处理免疫昆明系小鼠攻击血吸虫尾蚴,7周后剖杀小鼠冲虫,进行成虫和虫卵计数,其数虫率为35．2％,减卵率为37．8％,与对照组比较差异显著,初步证明血吸虫抱雌沟蛋白具有一定的免疫保护功能。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫SjZFP1181-786 bp基因序列编码蛋白的免疫保护效果评估

根据日本血吸虫锌指蛋白SjZFP1的抗原位点预测结果,选取编码基因中抗原表位富集的181~786 bp核苷酸序列(SjZFP1-1)表达制备重组蛋白抗原rSjZFP1-1/His,构建重组真核表达质粒pcDNA-SjZFP1-1,并开展动物免疫实验,评估免疫保护效果。在两次独立的免疫实验中,与相应对照组相比,rSjZFP1-1/His单独免疫组以及pcDNA-SjZFP1-1与rSjZFP1-1/His联合免疫组均产生较高水平的特异性抗体,但平均虫负荷、肝脏虫卵数无显著性减少。研究结果显示rSjZFP1-1/His不能诱导有效的抗感染免疫,今后可进一步开展SjZFP1蛋白N-端肽段编码序列的表达和效果评估。     

编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

日本血吸虫WD40信号蛋白的原核表达

本研究克隆了编码日本血吸虫WD40信号蛋白的cDNA,并分析了WD40在日本血吸虫不同发育时期的转录情况.同时还利用原核表达系统对该蛋白的部分序列进行了表达,并进行了重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备,Western blot分析表明本研究中获得多克隆抗体可与重组表达的蛋白和血吸虫全虫蛋白裂解物具有特异性反应.本试验结果为进一步研究WD40信号分子的功能奠定了初步基础.     

日本血吸虫蛋白质组学研究

蛋白质组学是研究一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上全部蛋白质及其存在方式的学科。近年来,应用蛋白质组学技术开展了日本血吸虫尾蚴、童虫、成虫蛋白质组,成虫性别差异和排泄分泌物蛋白质组,体被蛋白质组,与药物和诊断相关的蛋白质组等多方面的研究,增加了人们对日本血吸虫的生长发育、免疫逃避等机制的了解,为发掘血吸虫病疫苗、诊断和药物靶点提供了新的线索。     

日本血吸虫期别差异基因的Th细胞表位预测及串连多表位的原核表达

目的表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)转录本组中筛选获得的候选抗原基因Th细胞表位,以备免疫试验验证,为建立大规模、高通量、快速鉴定日本血吸虫Th细胞表位的方法奠定基础。方法应用数据挖掘技术,按照序列在不同期别转录本的数量,从Feng L iu等公布的转录本组EST序列中筛选出期别差异表达基因,选择具有完整可读框的序列作为抗原候选基因,其所编码蛋白按照有无信号肽和跨膜结构分为:信号肽跨膜结构组、非信号肽、跨膜结构组序列组。对编码蛋白应用表位预测服务器PRED-BALB/c、SYFPEIT、MHCPred、Rankpep分别对I-Ad、I-Ed、I-Ak、I-Ek型MHC分子进行表位预测。各期别各组筛选出5条最优混合预测表位。选择童虫期信号肽和跨膜结构组(m ep1)和非信号肽、跨膜结构组序列组(m ep2)的各5条最优15肽表位,分别设计并合成其编码核苷酸,克隆到原核表达载体pET-28 a( )进行表达、纯化。结果筛选到不同期别差异表达基因166条。表位预测后,总共筛选出40条最优混合表位,各期别各组5条。将童虫期目的基因m ep1和m ep2成功合成和克隆到了表达载体pET-28 a( ),目的基因m ep1表达量很高,而m ep2未见表达,纯化得到m ep1表达蛋白。结论成功表达了串连抗原表位,为进一步分析其免疫原性、鉴定出有效表位做好了准备。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗体水平检测与分析

东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，观察东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后的特异性抗体水平变化，可为阐明其抗病机制提供依据。本试验用间接ELISA方法检测东方田鼠抗成虫可溶性抗原（SWAP）和几种日本血吸虫基因重组抗原（Sj28-GST、LHD-SjTP1、C-SjParamyosion）的特异性抗体水平动态变化，并检测东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前、后的IgG3亚类特异性抗体水平。结果东方田鼠在攻击日本血吸虫尾蚴后，抗SWAP的特异性抗体水平有所升高，而抗几体基因重组抗原的特异性抗体水平低，没有显著变化。东方田鼠正常血清中抗SWAP和IgG3亚类抗体的OD值是牛血清白蛋白（BSA）对照的31倍。结果表明，在东方田鼠血清中有较高水平的SWAP的IgG3亚类抗体，值得进一步深入探讨。     

日本血吸虫病核酸疫苗的研究

核酸疫苗能同时诱发体液免疫和细胞免疫 ,具有众多传统疫苗无法比拟的优点 ,并且佐剂的应用能增强核酸疫苗的免疫效果。抗日本血吸虫核酸疫苗的研究在实验动物和牛、羊等大家畜上取得一定进展 ,混和或多价疫苗是未来核酸疫苗的发展方向     

东方田鼠重复感染日本血吸虫试验研究初步

本试验以1000条日本血吸虫尾蚴同时攻击感染东方田鼠洞庭湖种群和东方田鼠宁夏指名亚种进行重复感染对比试验，并在攻击后不同天数分别同时解剖相数目的两种群东方田鼠，收集其体内不同时段，不同部位的日本血吸虫童虫，比较结果证实东方田鼠对日本血吸虫具有天然的抗性，其抗性是可遗传的，不以东方田鼠的地域分布不同、生活环境的差异或传代数目的变化而有所不同，与获得必免疫无关。