鸡白细胞介素-2 cDNA克隆

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。     

鸡白细胞介素-2基因在Pichia methanolica酵母中的表达

鸡白细胞介素-2(chIL-2)是近年来新发现的一种禽类细胞因子.为建立用甲醇型酵母Pichia methanolica (P. methanolica)表达鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的新途径,将chIL-2基因插入到P. methanolica分泌型表达载体pMETαA构建了重组PMAD11表达菌株(pMETαA/rchIL-2).经SDS-PAGE、Western印迹测定,证实chIL-2基因在P. methanolica中表达成功,rchIL-2的分子量约为16 kDa,其表达量占分泌总蛋白的35%.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2（ChIL-2）基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K／ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母（Pichia methanolica）GS115甲醇利用型重组表达菌株．经SDS—PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16ku与14ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质．     

黑白花奶牛白细胞介素-2基因的克隆和表达

[目的]克隆牛白细胞介素-2基因(IL-2),并观察其在原核细胞中的表达。[方法]应用RT-PCR技术从黑白花奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增编码牛IL-2基因,并将其克隆到pGEX-2T原核表达质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析。[结果]通过RT-PCR扩增获得500 bp的目的片段,所克隆的IL-2基因在原核细胞中成功表达,表达产物为分子量约43 kD的融合蛋白。[结论]该研究为IL-2基因的进一步研究提供了理论依据和物质基础。     

鸡白细胞介素2原核表达及多克隆抗体的制备

鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子.本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2.SDS-PAGE结果表明,萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了表达,以此表达产物制成油乳剂苗免疫家兔,用ELISA和Western blotting检测兔血中的多克隆抗体,结果均为阳性.因而为进一步开展鸡IL-2的结构和功能研究奠定了基础.     

固始鸡白细胞介素2 cDNA的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经conA诱导的20~35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出基因片段.将其连接到克隆质粒pGEM-T,转化JM109,选择培养基筛选,酶切和测序鉴定,证明克隆基因为鸡白细胞介素2基因.与已公布的崇仁麻鸡、印度肉鸡、丝毛鸡、来杭鸡、仙居鸡、肖山鸡品种IL-2基因序列比较,在ORF内有2个核苷酸发生变异,其核苷酸序列同源性分别为:99.3%,99.1%,98.4%,99.3%,98.6%,99.5%;其编码的氨基酸序列同源性分别为:97.9%,97.9%,95.8%,97.9%,96.5%,98.6%.     

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白.重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达.HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性.     

鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素IS(ChlL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18.将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌B121(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18).SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18.Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应.融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性.     

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏茵ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为栽体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性,重组ZJ111/pCI-IL-2茵能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P＜0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.     

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

    为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200 μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P＜0.05).     

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用RT-PCR方法从鸡新城疫 系疫苗接种鸡胚的脾淋巴细胞中扩增出IL-2基因cDNA。结果表明,以鸡新城疫 系疫苗稀释50倍或100倍接种10日龄鸡胚,培养48h的脾脏提取mRNA的扩增效果最好。测序结果显示,所扩增片段的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,与已发表的IL-2基因的同源性分别为97.7%～99.8%和95.1%～99.3%。其中第8位、68位和130位氨基酸(分别是L,V和S)的变异是其他品种鸡所没有的。     

鸡白介素-6(ChIL-6)基因的克隆与序列分析

分别用鸡传染性法氏囊病病毒感染和用ConA免疫刺激健康鸡，无菌取处理鸡的脾脏，匀浆后用Tr-izol抽提细胞总RAN，应用随机引物反转录获得cDNA，设计引物，经PCR扩增获得鸡白介素-6（ChIL-6)基因，应用pGEM-T载体克隆该基因，经测序，表明其与Gene Bank中公布的唯一的一个ChIL-6基因为同源基因。     

几种中药成分与IL-2免疫协同作用的比较

将420羽罗曼雏鸡随机均分为14组,14日龄时用新城疫Ⅳ系苗免疫,并分别肌肉注射当归多糖（CAPS）、黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、淫羊藿多糖（EPS）、蜂胶黄酮（PF）和人参皂苷（GS）6种中药成分加白介素2（IL-2）,每天1次,连用3d。分别在不同时间点检测新城疫病毒HI（NDV-HI）抗体效价,并计算免疫器官指数。结果表明,APS、IRPS、EPS、PF和GS加IL-2在免疫后7～14d都能显著提高抗体效价,APS、IRPS和EPS加IL-2在免疫后4周显著促进免疫器官发育。提示,中药成分与IL-2合用有一定的免疫协同作用。     

鸡白细胞介素-2的研究进展及应用前景

鸡白细胞介素-2(IL-2)是由激活的T细胞分泌产生的糖蛋白,是鸡体内一类重要的细胞因子,在机体的免疫应答中起重要作用。近年来,随着鸡的IL-2基因克隆成功,使鸡的IL-2研究及应用得到了一定的发展,同时作为免疫增强剂和构建新型基因工程疫苗呈现出一定的应用前景。     

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.     

大肠杆菌表达重组牛IL-2复性技术的研究

研究了重组牛白介素2复性条件,如pH,蛋白浓度,DTT浓度,氧化剂(GSSG)和还原剂(GSH)的比例,Cu2 及L-Arg,低浓度的盐酸胍的添加,复性方法等。结果表明,复性液中添加20 mmol/mL DTT可以提高rBoIL-2的复性效率;利用尿浓度梯度复性法3.5 mg/mL的rBoIL-2蛋白溶液复性率可达50%以上,测定活性效价达9.6×104IU/mL。