一株H5亚型禽流感病毒N P蛋白两个鸡M HC分子限制性T细胞表位的鉴定

为验证一株禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)中的3条T细胞表位候选肽NP89-97(PKKTGGPIY)、NP198-206(KRGINDRNF)和NP64-71(ERMVLSAF)的免疫原性,本研究构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,间接免疫荧光和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得表达.重组质粒免疫鸡后,用间接酶联免疫实验检测发现重组质粒在鸡体内能诱导产生相应的抗体.将多肽NP89-97、NP198-206、NP64-71和不相关肽N71-78(WRRQARYK)在体外刺激免疫后鸡的脾淋巴细胞,流式细胞术检测发现CD8+T淋巴细胞增殖分别为13.7%、11.9%、0.6%和0.4%;ELISA检测结果显示多肽NP89-97、NP198-206刺激后的淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加.本实验表明多肽NP89-97和NP198-206能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,为AIV NP的T 细胞表位.该研究结果对研究禽类抗流感病毒的免疫机制及抗流感疫苗具有重要的意义.     

PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。     

CHD9:一个新的与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子

PA蛋白是禽流感病毒(AⅣ)聚合酶的组成部分,对AIV的复制具有重要作用.为鉴定家鸭体内与AIV PA蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究利用酵母双杂交系统,以表达A/goose/Hubei/65/05(H5N1)AIV PA蛋白的重组质粒为诱饵,筛选家鸭脑组织cDNA文库,鉴定得到一个cDNA片段,经测序分析表明,该cDNA片段编码蛋白为色素域解旋酶DNA结合蛋白9(CHD9).将重组诱饵质粒pDEST32-PA与捕获的鸭cDNA重组质粒共转化MaV203受体菌,进行X-gal显色反应检测,分析结果显示,菌落可以迅速变蓝,并且菌落在SC-Leu-TrpHis+3AT 3种营养缺陷培养基平板上生长良好.证明CHD9与PA蛋白在酵母双杂交系统中具有较强的相互作用.CHD9的初步鉴定为研究AIV在机体中的复制过程奠定了基础.     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

重配H9N1亚型流感病毒感染性克隆的构建及鉴定

为了研究禽流感病毒的反向遗传,试验采用霍夫曼发明的8质粒拯救系统,将分离得到的AIV Isolate3(H9N2)基因组,通过RT-PCR得到HA基因,并克隆到以pcDNA3质粒为骨架自行构建的双向转录/表达载体pHW2008上,得到HA转录/表达质粒,再将HA表达质粒与构建好的包含A/Puerto Rico/8/34(H1N1)7个内部基因双向转录/表达质粒共转染人肾上皮细胞(293T)与犬肾细胞(MDCK)混养细胞。结果表明:试验成功构建了重配H9N1亚型流感病毒减毒株。     

靶向IRES序列的siRNA对口蹄疫病毒体外增殖抑制效果

为探讨靶向核糖体进入位点(IRES)区域的siRNA在真核细胞中对FMDV复制的抑制作用,对FMDV WFL株的IRES序列进行了保守性分析和二级结构预测,选择了靶向IRES保守的功能核心区的病毒复制原点附近的2个干扰靶位,设计并构建了shRNA真核表达质粒,转染到IBRS-2细胞后感染FMDV,通过双抗夹心ELISA和real-timeRT-PCR检测FMDV复制情况,结果表明,针对IRES区域的RNAi能够在一定程度上抑制FMDV的复制。     

流感病毒的核蛋白是一种多功能RNA结合蛋白

流感病毒核蛋白 (NP)的主要功能是使病毒基因组衣壳化 ,以便 RNA转录、复制和病毒子装配。本综述的目的是说明 NP不仅是一种RNA结合的结构蛋白 ,而且作为病毒与宿主细胞之间的一种关键的配体分子而起作用 ,通过病毒和细胞的大分子之间相互作用来发挥其功能 ,包括 RNA、NP、病毒 RNA依赖的 RNA聚合酶和病毒基质蛋白。 NP也与细胞多肽相互作用 ,细胞多肽包括肌动蛋白、细胞核输入和输出装置所需的成分和细胞核 RNA解旋酶     

Sequencing and mutational analysis of the non-coding regions of influenza A virus

The genome of influenza A virus consists of eight negative-stranded RNA segments which contain one or two coding regions flanked by the 3' and 5' non-coding regions (NCRs). Despite the importance of NCRs in replication and pathogenesis of influenza virus, sequencing of influenza virus genome has mainly been focused on coding regions of the individual genes and very limited NCR sequences are available. In this study, we sequenced the NCRs of seven influenza A virus strains of different host origin and varying pathogenicity using two recently developed methods [de Wit, E., Bestebroer, T.M., Spronken, M.I., Rimmelzwaan, G.F., Osterhaus, A.D., Fouchier, R.A., 2007. Rapid sequencing of the non-coding regions of influenza A virus. J. Virol. Methods 139, 85-89; Szymkowiak, C., Kwan, W.S., Su, Q., Toner, T.J., Shaw, A.R., Youil, R., 2003. Rapid method for the characterization of 3' and 5' UTRs of influenza viruses. J. Virol. Methods 107, 15-20]. In addition to sequence and length variation present in the segment-specific NCRs among different influenza strains, we also observed sequence variations at the fourth nucleotide of 3' NCR of polymerase genes. To evaluate the role of sequence change in the NCRs in reporter gene expression, we introduced mutations at the NCRs of two polymerase gene segments, PB1 and PA, and created the green fluorescent protein (GFP) reporter plasmids. By measuring the GFP expression level, we confirmed that single or two mutations introduced at the 3' and 5' NCRs of PB1 and PA gene could alter the protein expression levels. Our study reaffirms the importance of NCRs in influenza virus replication and further analysis of their roles will lead to better understanding of influenza pathogenesis.     

RNAi靶向N基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

根据编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因的序列,设计3个干扰靶位(N12、N23、N26),构建siRNA表达载体,转染Marc-145细胞后接毒,测定病毒TCID50、CPE,并利用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光检测病毒在Marc-145细胞上的复制情况。结果表明,利用RNAi技术靶向N基因,其中N12干扰靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因,所选的干扰靶位是病毒复制的关键性位点。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础.     

靶向Pol基因siRNA抑制J亚型禽白血病病毒复制的研究

为筛选能够有效抑制J亚型禽白血病病毒(ALV-J)复制的siRNA,本研究根据ALV的pol基因保守序列设计合成5对shRNA序列,并将其分别克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建siRNA表达重组质粒,分别为pcDNA-sh-po1711、pcDNA-sh-po1814、pcDNA-sh-po11016、pcDNA-sh-po11915和pcDNA-sh-po12516.将重组质粒分别转染DF-1细胞6 h后,以100TCID50的ALV-J感染细胞,并利用IFA、western blot和real-timePCR方法评价其对ALV-J复制的抑制效果.IFA和western blot检测结果表明:其中pcDNA-sh-po1711、pcDNA-sh-po1814和pcDNA-sh-po12516可以有效抑制病毒囊膜蛋白的表达.Real-time PCR结果显示:与阴性对照和空载体对照相比,这3种siRNA在mRNA水平对ALV-J的抑制率达29%～86%.本研究在细胞水平上筛选的siRNAs可作为候选siRNAs,为抗鸡ALV-J的研究奠定基础.     

Suppression of bovine viral diarrhea virus replication by small interfering RNA and short hairpin RNA-mediated RNA interference

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a ubiquitous viral pathogen that affects cattle herds' worldwide causing significant economic loss. The current strategies to control BVDV infection include vaccination (modified-live or killed) and control of virus spread by enhanced biosecurity management, however, the disease remains prevalent. With the discovery of the sequence-specific method of gene silencing known as RNA interference (RNAi), a new era in antiviral therapies has begun. Here we report the efficient inhibition of BVDV replication by small interfering (siRNA) and short hairpin RNA (shRNA)-mediated gene silencing. siRNAs were generated to target the 5' non-translated (NTR) region and the regions encoding the C, NS4B and NS5A proteins of the BVDV genome. The siRNAs were first validated using an EGFP/BVDV reporter system and were then shown to suppress BVDV-induced cytopathic effects and viral titers in cell culture with surprisingly different activities compared to the reporter system. Efficient viral suppression was then achieved by bovine 7SK-expressed BVDV-specific shRNAs. Overall, our results demonstrated the use of siRNA and shRNA-mediated gene silencing to achieve efficient inhibition of the replication of this virus in cell culture.     

In vitro inhibition of feline coronavirus replication by small interfering RNAs

Infection with virulent biotypes of feline coronavirus (FCoV) can result in the development of feline infectious peritonitis (FIP), a typically fatal immune mediated disease for which there is currently no effective antiviral treatment. In this study we demonstrate the ability of small interfering RNA (siRNA) mediated RNA interference (RNAi) to inhibit the replication of virulent FCoV strain FIPV WSU 79-1146 in an immortalised feline cell line. A panel of eight synthetic siRNAs targeting four different regions of the FCoV genome were tested for antiviral effects. Efficacy was determined by qRT-PCR of intracellular viral genomic and messenger RNA, TCID50 infectivity assay of extracellular virus, and direct IFA for viral protein expression. All siRNAs demonstrated an inhibitory effect on viral replication in vitro. The two most effective siRNAs, targeting the untranslated 5' leader sequence (L2) and the nucleocapsid gene (N1), resulted in a >95% reduction in extracellular viral titre. Further characterisation of these two siRNAs demonstrated their efficacy when used at low concentrations and in cells challenged with high viral loads. Taken together these findings provide important information for the potential therapeutic application of RNAi in treating FIP.     

表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。     

整合H1亚型流感病毒血凝素蛋白伪型病毒的构建

为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具.     

猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用

根据GenBank中A/Swine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品.经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD.用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应.正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应.通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上.试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求.目前正在进行现地的中试试验.     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

利用RNAi技术靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制

构建了针对新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi质粒;转染质粒36 h后接种NDV,通过对病毒滴度测定、实时荧光定量PCR和细胞病变结果分析,表明其能抑制NDV在CEF中的复制和增殖.本试验为进一步研究NDV复制机理和抗病毒治疗提供了技术基础.