陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

陆川猪MYL2基因生物信息学分析、真核表达载体构建及组织表达研究

【目的】了解陆川猪肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)基因CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,探究MYL2基因对肌肉生长发育的影响,为陆川猪的开发利用提供分子基础。【方法】采用RT-PCR技术扩增陆川猪MYL2基因CDS区,利用MegAlign软件对陆川猪MYL2基因与不同物种进行相似性比对和系统进化树构建,并通过生物信息学软件分析MYL2蛋白理化性质、疏水性和跨膜结构等;构建MYL2基因真核表达载体,利用脂质体法将重组质粒转染C2C12细胞并观察荧光;通过实时荧光定量PCR检测MYL2基因在陆川猪不同组织中的表达情况。【结果】陆川猪MYL2基因CDS区全长501 bp,编码166个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MYL2基因相似性为99.6%,存在2处突变：156 bp处C突变为T,为同义突变;404 bp处T突变为C,使异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。生物信息学分析显示,MYL2蛋白原子总数为2 633个,分子质量为18.879 ku,理论等电点(pI)为4.83,不存在跨膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。MYL2蛋白有16个位点可能会被磷酸化,在第...     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

猪A-FABP基因真核表达载体的构建及其组织表达

本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。     

抗菌肽Cecropin P1基因真核表达载体的构建

选择大肠杆菌偏爱密码子，人工设计合成3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段，通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因的全序列，并将其克隆到T-easy载体上，经双酶切重组于真核表达质粒pcDNA3.1（+）上，经酶切鉴定和序列分析，抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建成功。抗菌肽Cecropin P1基因表达载体的成功构建，为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用等打下基础。     

陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1基因克隆及序列分析

本研究旨在对陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1（acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1）基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中猪ACOX1基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术对陆川猪ACOX1基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明,陆川猪ACOX1基因CDS全长1 986 bp,编码661个氨基酸,陆川猪ACOX1基因与猪、牛、人、斑马鱼、鸡、猕猴、大鼠、小鼠、爪蟾序列同源性分别为99.5%、85.5%、87.1%、66.3%、75.6%、84.0%、82.3%、81.1%和69.1%。系统进化树分析结果表明,ACOX1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪ACOX1蛋白没有信号肽,没有形成跨膜结构。本研究成功克隆了陆川猪ACOX1基因,为阐明其在陆川猪脂肪沉积及代谢方面的调控研究奠定了理论基础。     

Cloning and Sequence Analysis of ACOX1 Gene in Luchuan Pig

The objective of this study was to clone the acyl-coenzyme A oxidase 1 (ACOX1) gene of Luchuan pig and analyze its genetic structure with bioinformatics. A pair of special primer was designed according to predicted sequence of pig ACOX1 gene in GenBank. The ACOX1 gene was amplified by RT-PCR, the physicochemical property and secondary structure of ACOX1 gene were systemically analyzed by bioinformatics techniques. The results showed that ACOX1 gene fragment included an 1 986 bp whole length CDS (coding 661 bp amino acids). The sequence multi-aligned results showed that Luchuan pig shared 99.5%, 85.5%,87.1%,66.3%,75.6%,84.0%,82.3%,81.1% and 69.1% of similar nucleotide sequence with that of pig,human, zebrafish, chicken, rhesus monkeys, mice, rat and frog, respectively. The prediction of ACOX1 secondary structure showed that Luchuan pig ACOX1 had no signal peptide and transmembrane structure. This study suggested that the whole CDS sequence of ACOX1 gene was successfully cloned in Luchuan pig, and the cloning and analysis of ACOX1 gene provided an important foundation for further studying on the fatty deposition and lipornetabolism of ACOX1 gene in Luchuan pig.     

莱芜猪PID1基因的功能分析及表达谱研究

为进一步了解莱芜猪PID1基因的结构和功能,本研究以莱芜猪为试验对象,分析PID1基因的结构和功能,并利用SYBR-Green实时荧光定量PCR方法,分析该基因在莱芜猪10个不同组织(心脏、背最长肌、脾脏、肝脏、肺脏、小肠、大肠、脑、脂肪、脊髓)的表达谱信息.生物信息学分析表明:PID1基因编码含217个氨基酸的蛋白,...     

Cloning and Sequence Analysis of PTTG1 Gene in Luchuan Pig

This experiment was aimed to clone PTTG1 gene CDS sequence of Luchuan pig,and was analyzed by bioinformatics methods.A pair of special primers was designed according to predicted sequence of porcine PTTG1 in GenBank.The coding sequence of PTTG1 in Luchuan pig was amplified by RT-PCR,its gene sequence characteristics and protein structure was systemically analyzed by bioinformatics techniques.The results showed that the cloned PTTG1 fragment included a 609 bp CDS (coding 202 amino acids).The sequence multi-aligned results showed that Luchuan pig shared 90.15%,87.85%,87.52%,87.03%,76.03%,74.38%,55.74% and 44.48% of similar nucleotide sequence with that of Bos,Pan troglodytes,Homos,Macaca,Rattus,Mus,Gallus and Danio retio,respectively.The protein structure analysis results showed that the protein attributed hydrophilic protein without signal peptide,localized in cell cytoplasm and had 16 phosphorylation sites.The phylogentic tree of amino acid indicated that PTTG1 was highly conserved in the process of evolution of different species.The cloning and analysis of PTTG1 gene provided an important foundation for further study biological function of porcine PTTG1 during early embryonic development.     

陆川猪PTTG1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆陆川猪PTTG1基因全长CDS序列并对其进行生物信息学分析。利用GenBank公布的猪PTTG1预测序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学软件分析和预测了陆川猪PTTG1基因的理化性质与二级结构。结果表明,陆川猪PTTG1基因全长CDS序列为609 bp,编码202个氨基酸;其核苷酸序列与牛、黑猩猩、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼相对应序列同源性分别为90.15%、87.85%、87.52%、87.03%、76.03%、74.38%、55.74%和44.48%;PTTG1基因编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,存在16个磷酸化位点。氨基酸系统进化树分析表明,不同物种PTTG1基因在进化过程中具有高度保守性。本研究成功克隆了陆川猪PTTG1基因,为今后研究PTTG1基因在猪早期胚胎发育过程中的作用奠定理论基础。     

陆川猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪磷酸酪氨酸互作结构域1(phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)基因进行克隆和生物信息学分析。利用GenBank公布的猪序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学方法分析和预测了陆川猪PID1基因的理化性质与二级结构。结果显示,陆川猪PID1基因编码区全长654bp,编码217个氨基酸;陆川猪PID1基因与莱芜猪、牛、猕猴、人、小鼠、原鸡、大鼠、斑马鱼和非洲爪蟾相对应序列相似性分别为99.08%、87.61%、93.88%、93.58%、90.06%、83.79%、66.94%、66.52%和60.09%。系统进化树分析结果表明,PID1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。本研究成功克隆陆川猪PID1基因,为阐明其在陆川猪生长发育及脂肪沉积方面的调控研究奠定了理论基础。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999 bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906 bp处为同义突变,110和278 bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。