猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月~2009年3月采集剖检病死猪喉拭样品41份,从中分离鉴定了2株H9N2亚型猪流感病毒,对其进行部分生物学特性的研究、全基因测序和遗传演化分析,发现血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白335~338的裂解位点上,A/Swine/Yangzhou/1/08为RSNR,A/Swine/Taizhou/5/08为RSSR,均为典型低致病性禽流感病毒的特征性序列。2株病毒的HA、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）、非结构蛋白（nonstructural protein,NS）、血清前白蛋白（prealbumin,PA）和多聚酶蛋白（polymerase protein1,PB1）基因均来源于A/Chicken/Shanghai/F/98,基质蛋白（matrix,M）基因与A/Swine/Yangzhou/1/08的PB2基因来源于A/Quai/Hong Kong/G1/97,值得注意的是A/Swine/Taizhou/5/08的PB2基因虽然可能来源于A/Chicken/Shanghai/F/98但与A/environment/Hunan/1-35/2007（H5N1）的高度同源,生物学特性试验也表明A/Swine/Taizhou/5/08比A/Swine/Yangzhou/1/08毒力强。     

H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞中增殖最佳条件研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞中增殖的最佳条件,将不同毒株、不同接种量的H9N2亚型禽流感病毒接种MDCK细胞单层,接毒后直接加入或吸附lh后加入含有10 μg/mL胰蛋白酶的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定细胞上清液中HA滴度.结果表明,分离株HN04在MDCK细胞中增殖能力较其他2株强...     

中国猪源HSN1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定

猪是禽流感病毒"禽-猪-人"传播链中重要的中间宿主,了解猪流感的疫情动态将为动物流感及人流感的疾病预测及防制提供重要依据.1999～2001年间进行的血清学和病毒学监测发现我国猪群存在大范围的H1和H3亚型猪流感感染(李海燕等,2002).2002～2003年,我们进一步对来自全国14个省市的1936份血清进行了H9亚型猪流感的检测,同时在广东、福建等省进行了H5亚型猪流感的检测.2002年辽宁、广东、山东及重庆猪血清中出现H9亚型流感抗体,阳性率分别为7.3%、6.8%、5.1%和1.6%.2003年采集的猪血清H9亚型流感抗体均为阴性,同时发现广东、福建两省2003年出现H5亚型流感阳性猪群,阳性率分别为4.7%和8.2%.从2001～2003年收集和送检的样品中分离鉴定了6株H9N2亚型和2株H5N1亚型猪流感病毒,部分序列分析发现H9和H5亚型猪流感病毒均与我国分离的禽流感病毒高度同源.本研究进一步确证了我国猪群中存在H9N2亚型流感病毒,并且首次发现我国猪群已出现H5N1亚型流感病毒,为人类流感及动物流感的防制敲响了警钟.对这两个亚型流感病毒所具有的公共卫生和兽医公共卫生危害性应予以高度重视.     

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制.分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明...     

1株猪源H9N2亚型流感病毒的分子特征

旨在进一步了解山东省猪流感的流行情况及其病原特征,笔者于2019年春季,在山东省泰安某屠宰场采集130份猪鼻拭子,进行病毒分离鉴定;并对分离病毒进行全基因组测序和分子特征分析;用禽H9N2亚型标准抗原联合血凝抑制方法检测2018—2019年从山东省8个地区猪场采集的1 527份猪血清样品中的猪流感病毒抗体。结果显示：分离到1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/swine/Shandong/TA009/2019（H9N2）。分离病毒与A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL20/2018（H9N2）和A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL25/2018（H9N2）遗传关系最近,其基因片段的核苷酸相似性均在99.5%以上。分离病毒的HA和NA基因属于Y280-like分支,PB2和M基因属于G1-like分支,PB1、PA、NP和NS基因属于SH/F98-like分支。分离病毒HA蛋白裂解位点处的氨基酸序列为“PSRSSR/GL”,符合低致病性禽流感病毒的分子生物学特性。HA蛋白的216位为L,具有结合人源唾液酸α 2,6-Gal的能力。血清学分析结果显示,9份血清中H9N2抗体呈阳性,其总阳性率为0.59%。综上：本研究分离到1株猪源H9N2亚型流感病毒,并在猪血清中检测到H9N2抗体,提示应加强对猪流感的流行情况及其病原特征的持续监测。     

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠肺急性损伤模型的研究

本试验采用100 μLA/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)猪流感病毒(H9N2 SIV)经鼻腔接种6～8周龄的BALB/c小鼠,通过定时称量小鼠的采食量和体质量、观察肺病理组织学变化以及测量肺系数、肺湿质量/干质量、动脉血气和支气管肺泡灌洗液内炎性细胞等拟建立H9N2 SIV感染诱导小鼠急性肺损伤模型.结果显示:(1)感染后第2天试验组小鼠出现精神沉郁、被毛松乱、采食量和体质量下降.感染后的第3天开始感染小鼠采食量和体质量显著下降(P＜0.01);(2)试验组小鼠在感染后的第3天末出现死亡,死亡率约为62.5%,剖检可见肺部明显水肿、出血,肺泡内有大量的炎性细胞渗出;肺系数和湿质量/干质量比显著增加(P＜0.01);(3)与对照组相比感染组小鼠动脉血中氧分压从第2天开始降低,第4天出现明显的差异(P＜0.01),第6天最低时仅为(6.79士1.27)kPa,呈现严重的低氧血症,同时,二氧化碳分压显著上升;(4)支气管灌洗液(BALF)内炎性细胞在感染后第4-8天增加显著,尤其以肺泡巨噬细胞和多核型白细胞增加最为明显(P＜0.01).本研究证实采用A/Swine/HeBei/012/2008/(H9N2)病毒感染小鼠引起肺组织弥漫性急性渗出性炎症为主的病理过程和严重的低氧血症,表明成功建立了H9N2 SIV诱导小鼠的肺损伤模型,为进一步研究其对哺乳动物肺损伤的致病机理奠定基础.     

猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性及其分子特性研究

本实验从河北地区疑似流感发病猪体内分离到一株病毒,经鉴定为H9N2亚型猪流感(SIV)病毒.将该分离株经滴鼻、点眼途径感染小鼠,观察临床症状和病理变化,同时对血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)和基质蛋白基因(M)进行克隆和序列测定,与GenBank中登录的相关序列进行比对并绘制系统发育进化树.致病性结果显示:感染小鼠出现精神不振,体重下降,并引起以弥漫性肺泡损伤为主的临床症状和病理变化.序列分析结果显示:该分离株与禽流感病毒(AW) A/chicken/Hebei/4/2008 (H9N2)(简称CK/HB/4/08)参考株的HA、NA、NP和M基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性最高.HA蛋白的裂解位点序列为PARSSR↓GLF,属于低致病性流感病毒的裂解位点.HA、NP、NA和M基因的遗传进化分析均显示该分离株与AIV的CK/HB/4/08株位于同一分支,具有较近的亲缘关系;由此推测该分离株可能是由CK/HB/4/08演化而来,并在跨物种传播的过程中发生了部分变异.     

H9N2亚型猪源性流感病毒在小鼠肺微血管内皮细胞内最佳增殖条件的研究

试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒(SIV)在小鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL)、不同H9N2亚型SIV(A/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)接种剂量(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000和1∶10 000 000)及不同病毒吸附时间(0.5、1.0、2.0和3.0h)条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10-2病毒稀释倍数感染条件下48和72h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2h且中间震荡20s的条件下H9N2HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3μg/mL、病毒接种浓度为10-2、吸附时间为2h且中间震荡20s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。     

H9N2亚型禽流感病毒的研究现状

H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认,并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注,相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据,通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组,可以形成新的病毒株,引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒,防止人类流感大流行。     

Molecular Characterization of a H9N2 Subtype Swine Influenza Virus

The objective of this study was to explore the epidemic situation and pathogenic characteristics of swine influenza virus (SIV) in Shandong Province. In the spring of 2019, 130 swine nasal swab samples were collected from a slaughterhouse in Tai'an city, Shandong Province for virus isolation and identification. The whole genome of isolated virus was sequenced and analyzed. Meanwhile, 1 527 swine serum samples were collected from swine farms in 8 regions of Shandong province and their anti-SIV antibody were detected by HI assay using standard avian H9N2 antigen. The results showed that a H9N2 subtype influenza virus strain was isolated and named as A/swine/Shandong/TA009/2019(H9N2). The homology analysis showed that the isolated virus had close genetic relationship with A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL20/2018(H9N2) and A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL25/2018(H9N2), and the nucleotide homology of the gene fragments were above 99.5%. Phylogenetic analysis results demonstrated that HA and NA genes of the isolated virus belong to the Y280-like lineage, PB2 and M genes belong to the G1-like lineage, and PB1, PA, NP and NS genes belong to the SH/F98-like lineage. The cleavage site in HA protein is “PSRSSR/GL”, which was in accordance with the molecular biological characteristics of low pathogenic avian influenza virus.The position 216 of HA protein is L, and it has the ability to bind human-derived sialic acid α 2,6-Gal. The results of HI showed that 9 among 1 527 serum samples were positive with a positive rate of 0.59%. The isolated virus was swine-derived H9N2 virus, and serological investigations revealed that H9N2 subtype virus infection was present in swine herds in Shandong Province. The results of this study suggest that continuous surveillance of the SIV epidemiological situation and its pathogenic characteristics should be strengthened.     

H9N2亚型禽流感流行现状

低致病性禽流感主要是由H9N2亚型禽流感病毒所引起,近几年在世界上许多国家都暴发了H9N2亚型禽流感疫情.研究表明,H9N2亚型禽流感病毒在陆禽中至少可分为北美和欧亚两个种系,该病毒在自然环境中很容易发生变异,通过混合基因组分而形成不同的病毒亚型.H9N2亚型禽流感病毒已经能传播至哺乳动物,包括猪和人类,从而引发对其是...     

33株H9N2亚型禽流感病毒分离株分子流行特点的研究

在1998至2007年期间,采集了我国不同地区、不同宿主来源的H9N2亚型禽流感病毒株,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA基因,获得33株H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列。结合GenBank中公开发表的其他国内H9亚型禽流感HA基因序列共65株,应用计算机软件绘制进化树,进行H9亚型禽流感病毒谱系全景分析,探索H9亚型禽流感的流行趋势。分析结果表明:这65株的基因进化树主要分为三个系列,每个系列毒株均呈现全国性流行分布;三个系列毒株可在同一时间段内、同一地区发生流行;不同时间的流行毒株虽有变异,但大部分归属于三个系列中。无论从时间的推移上还是地域的转变中,病毒均没有表现出明显的时间演变与地理分布特征,进一步显示了H9亚型禽流感的复杂性和多样性。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

H9N2亚型禽流感病毒与其他病原混合感染的研究进展

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于低致病性AIV,但因其分布广泛、传播迅速,可引起感染家禽生产性能下降,给家禽业带来了极大的经济损失。H9N2亚型AIV在感染家禽过程中可引起严重的免疫抑制,使家禽极易继发上呼吸道细菌、消化道细菌等感染,从而导致H9N2亚型AIV致病力增强,细菌黏附定植能力增强,家禽死亡率显著升高。另外,H9N2亚型AIV还能与禽传染性支气管炎病毒、禽传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒等发生混合感染,病毒入侵时有可能出现协同作用或颉颃作用,从而相互促进或抑制病毒的复制和排毒;H9N2亚型AIV还极易发生突变或与其他亚型流感病毒在混合感染时发生基因重组产生感染人的新亚型毒株,给人类健康和公共卫生安全带来重大威胁。作者综述了H9N2亚型AIV与其他病原混合感染的研究进展,通过阐述H9N2亚型AIV与细菌或病毒混合感染的协同或颉颃作用,以期为临床上H9N2亚型AIV混合感染的防治提供参考。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

一株绿鹭源H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

为了解野生水禽绿鹭(Butorides striata)中分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(A/striated heron/Yunnan/2018)的生物学特性;对其进行全基因组序列扩增、测序、进化分析;序列分析显示:该分离株HA、NA基因位于Y280-like分支、PB2、M基因位于G1-like分支、PA、PB1、NP、NS基因位于F98-like分支,分别与H9、H7、H10等多种亚型的AIV同源性较高,该分离株不同基因片段来源较复杂。HA裂解位点氨基酸序列为333PSRSSR↓GL340,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征;S145N突变增加了一个糖基化位点,提示该位点出现可能会使毒株致病性提高,免疫原性发生改变;HA受体结合位点发生Q234L突变,表现出人流感病毒受体结合特性;NA基因出现第63—65位氨基酸缺失,M1发生N30D,T215A突变,M2发生S31N的突变,PB2、PB1、NS、NP、PA关键位点未发生变化,分析结果提示当前分离株已出现耐药性、致病性增强的变化。本研究表明该分离株呈现遗传演化的多样性及基因重组的复杂性,因此加强对野生水禽类禽流感病毒的监测和研究具有重要的公共卫生意义。