鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptorα,RORα)的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列(登录号:NM_001289887.1)设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用SalⅠ和BamHⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600bp的特异性片段,用SalⅠ和BamHⅠ可切出大小约4 700和1 600bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加(P0.05)。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX—S—N的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础.     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为1 038和4 700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为...     

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。     

奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

鸡B-F2基因真核表达系统的建立与鉴定

鸡B-F2基因编码的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子α链在递呈内源性抗原中起重要作用。本研究应用RT-PCR方法从鸡外周血单核细胞中扩增了B-F2基因片段,其大小为1 068 bp。进一步将其定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-B-F2。经脂质体法转染COS7,所表达的α链定位于在细胞的浆膜,同时转染P815细胞,经G418的筛选(0.6 mg/mL)得到稳定表达细胞株。该细胞株经培养10代次后,仍在RT-PCR中能获得相应DNA片段。上述结果表明,B-F2基因在动物真核表达系统得到表达,建立的P815(B-F2)细胞株为进一步研究MHC I类分子α链在免疫应答中作用奠定了基础。     

努比亚山羊脂肪和肥胖相关蛋白基因克隆分析及真核表达载体构建

研究旨在对努比亚山羊脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesityassociated protein,FTO）基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。取努比亚山羊背最长肌组织作为试验材料,采用RT-PCR扩增出FTO基因的编码区,测序鉴定后对得到的序列用相应的分析软件进行生物信息学分析,然后将FTO基因片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建pMD19-T-FTO载体,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体构建pEGFP-N1-FTO真核表达载体,然后转染3T3-L1细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞表达荧光的情况。结果表明,试验成功克隆了努比亚山羊FTO基因的编码区,序列长度为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子质量为57 142.24 u。努比亚山羊FTO基因编码区序列与NCBI上公布的山羊、牛、绵羊、猪、原鸡、小鼠的相似性分别为98.7%、96.4%、98.3%、87.2%、64.3%、81.7%,该基因系统进化树分析显示,努比亚山羊与山羊遗传距离最近,与原鸡遗传距离最远,在不同物种中具有高度保守性。努比亚山羊FTO蛋白二级和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pEGFP-N1-FTO转染3T3-L1细胞48 h后,在显微镜下观察到绿色荧光的表达,说明FTO基因真核表达载体构建成功。本试验构建努比亚山羊FTO基因真核表达载体,其在3T3-L1细胞中成功表达,为以后研究FTO基因与山羊脂肪代谢的相关性奠定基础。     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选

试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建与鉴定

(目的)构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因真核表达载体pCI-E,为探讨E基因的功能奠定基础。(方法)根据GenBank上已发表的PEDV CV777株序列,利用Primer5.0设计1对两端含限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的特异引物,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出完整的231bp的目的基因,将目的基因与pMD19-T载体连接转化到大肠杆菌DH5α中,用测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆体。然后将纯化后的E基因插入表达载体(pCI-neo)上,并经双酶切、测序鉴定。(结果)成功构建了PEDV的pCI-E重组真核表达载体。(结论)pCI-E重组真核表达载体的构建为进一步探讨PEDV E基因的功能和分子生物学特性及PED防御新途径提供依据。