紫花苜蓿种带阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及其致病性初步研究

采用稀释平板法从6种表面消毒的紫花苜蓿种子中分离和纯化出3株阪崎克罗诺杆菌疑似分离物。选取代表分离物1gF3室内条件下通过菌悬液(≈109 cfu·mL-1)浸种紫花苜蓿种子,皿内发芽;腹腔注射洁净级昆明小白鼠试验;测定阪崎克罗诺杆菌疑似分离物对紫花苜蓿和小鼠的致病性。结果表明,阪崎克罗诺杆菌疑似分离物对紫花苜蓿不致病;小鼠在接种分离物1gF3 12h后病理特征显示化脓性脑炎、心肌水肿扩张,局部心肌纤维有断裂、肝脏局部坏死、急性脾炎、肺部急性弥散性出血以及肾脏弥散性血管内凝血等症状,1gF3对小鼠具有致病性。发病小鼠血液涂板分离到阪崎克罗诺杆菌疑似分离物TM2。结合表型特征和16SrDNA鉴定,确定分离物1gF3和TM2为阪崎克罗诺杆菌。在此基础上,测定了菌株1gF3的生物学特性,该菌对数生长期为24~36h,之后衰退;干旱胁迫加重其生长量线性下降;菌株1gF3能在较宽温度(10~41℃)和pH(3~11)范围内生长;该菌不需盐生长,NaCl浓度上升该菌的生长量受到抑制;黑暗交替的光照有利其生长。研究材料为具有动物和植物跨域寄主特点的一类病原菌资源,研究结果对隐藏于植物或动物材料中跨域病原菌侵染传播特征及相关检疫防控提供了理论基础。     

奶牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

本研究旨在分离鉴定来自北京某奶牛场死亡奶牛肺脏的1株疑似病原菌CVCC 3982,并测定其致病性。通过分离培养获得疑似病原菌,采用Biolog鉴定系统和16S rDNA序列分析对其进行了鉴定,人工接种CD-1小鼠测定了其致病性,合成引物对其主要毒力基因进行了检测。结果显示,该疑似病原菌为革兰氏阳性杆菌,β溶血,Biolog鉴定结果显示其为化脓隐秘杆菌,其16S rDNA序列与化脓隐秘杆菌模式菌株NCTC 5224的同源性达100%,系统发育分析显示其与化脓隐秘杆菌处于同一分支。腹腔注射该菌可致小鼠死亡。分离菌株基因组中含有溶血素(PLO)基因,神经氨酸酶H(NanH)基因,神经氨酸酶P(NanP)基因,菌毛基因(fimA、fimC和fimE),但缺失胶原结合蛋白(CbpA)基因和菌毛fimG基因。结果表明该分离菌株为化脓隐秘杆菌且具有致病性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

吉林省某规模化养猪场送检疑似猪传染性胸膜肺炎的死猪病料,采用不同培养基进行病原菌分离,结果分离出3株疑似胸膜肺炎放线杆菌。通过对分离菌进行镜检、培养特性试验、生化特性试验、PCR鉴定,确定为3株均为胸膜肺炎放线杆菌,致病性试验结果表明,分离的胸膜肺炎放线杆菌具有强致病性。     

婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株检测方法研究进展

2008年,阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）被重新命名并被划分成一个新的属即克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）,是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌,也是一种重要的食源性条件致病菌。2012年,克罗诺杆菌属被进一步重新分类并包括7个种。该属菌株能引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症,严重的可引起神经系统后遗症和死亡。目前,国内外的多篇报道证明婴儿配方粉是其主要的传染源和传播媒介。因此,准确和快速鉴定克罗诺杆菌属菌株是预防和控制该病原菌的重要举措。本综述简要介绍了截止目前克罗诺杆菌属菌株的主要检测方法,期望能为我国检测机构提供一定的借鉴和帮助。     

禽霍乱多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

确定某鸭场疑似禽霍乱病的病原种类,为其临床用药提供参考。采用细菌分离技术对病原菌进行实验室分离培养,对分离到的病原菌进行了鉴定、动物攻毒试验、药敏试验和基因分型。结果显示,分离菌20170549具有多杀性巴氏杆菌典型培养特征,菌落形态和菌体染色特征、生理生化特性,基因测序结果均与多杀性巴氏杆菌相符;该菌株对小鼠有强致病性;分离株对头孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩诺沙星、卡那霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考高敏;采用5对分型引物对分离菌进行基因分型,结果仅扩增到大小为1 050bp的目的基因片段,与A型结果相符。研究结果可为禽霍乱的防控提供参考。     

紫花苜蓿根腐病原——厚垣镰刀菌的鉴定及其拮抗菌的筛选

采用常规组织分离法,对甘肃省武威市紫花苜蓿根腐病菌进行分离和致病性测定,并通过形态学特征和分子鉴定方法对致病性最强的菌株进行鉴定。结果表明,MXGF7可造成紫花苜蓿严重根腐,该病原菌大型分生孢子多纺锤形或镰刀形,大小为3.3～4.7μm×14.8～32.0μm;小型分生孢子少,纺锤形或哑铃形,大小2.9～4.2μm×8.4～18.2μm;ITS序列及镰孢菌Fu3/Fu4区基因序列分析表明,病原菌均与Fusarium chlamydosporum的相似度达99%,结合形态学特征将该病原菌鉴定为厚垣镰孢菌F.chlamydosporum。采用平板对峙法,从分离自东祁连山高寒草地牧草的123株内生细菌中筛选出61株菌株对F.chlamydosporum有拮抗效果,且抑菌率均在55%,并利用形态特征和16SrDNA基因序列分析将具有稳定拮抗作用265ZY3菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylolique　faciens。     

大肠杆菌分离鉴定及其耐药性试验

为了确定采集自内蒙古地区某牧场的病料内的病原菌,对其进行细菌的分离培养。将分离培养出的2株病原菌进行16S rDNA扩增、细菌生化鉴定、致病性试验以及细菌耐药性试验。结果表明,分离菌在伊红美蓝琼脂培养基上可生长出暗红色或黑色并且带有金属光泽的菌落;镜检可见,分离菌为革兰阴性杆菌;分离菌生化鉴定结果与大肠杆菌标准菌株ATCC 25922测定的结果相一致;分离菌的16S rDNA与大肠杆菌标准菌株16S rDNA PCR扩增结果相一致;分离到的2株大肠杆菌均具有致病性,对多种抗生素均有耐药性。结果提示,该次分离得到的病原菌主要为具有多重耐药性的致病性大肠杆菌。     

山羊伪结核棒状杆菌的分离与鉴定

近年来陕西省规模化羊场中病羊躯干出现脓包的情况不断出现。为了获得引起陕西某山羊场病羊脓包的病原菌,无菌采集病羊脓包液,进行细菌分离、革兰染色、生化试验、16S rDNA序列分析及小鼠致病性试验。结果:获得1株具有β溶血特性、菌落直径大小为1~2 mm、呈苍白色、表面粗糙的革兰阳性球杆菌;16S rDNA扩增大小为1 412 bp,比对结果显示与伪结核棒状杆菌ATCC 19410菌株的核苷酸相似性为99%;用0.2 mL/只(1×10~8cfu/m L)的菌液剂量接种昆明小鼠,死亡率为100%(10/10),最终确定分离纯化病原菌为具有致病性的伪结核棒状杆菌。药敏试验结果显示,分离菌对环丙沙星、头孢噻肟、氧氟沙星等多种抗生素敏感,对复方新诺明、杆菌肽等多种抗生素表现为耐药,药敏结果为该病的防治提供了依据。     

禽源鲍曼不动杆菌的分离鉴定和系统发育分析

为了确定河南某养鸡场鸡只发生细菌性感染死亡的病原,试验对发病蛋鸡的肝脏和脾脏进行细菌分离,并对疑似病原菌进行形态特征、培养特性的观察,以及生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验、特异性基因检测、16S rRNA基因序列分析并构建遗传进化树。结果表明:该分离菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),对阿米卡星等抗生素敏感,且对小鼠有较强的致病性,LD50达到1.4×108cfu/mL;16S rRNA基因序列与鲍曼不动杆菌的同源性达到99.9%,与不动杆菌属其他种的同源性为95.9%~97.9%;遗传进化树分析显示,其与人源的北京参考菌株ZW85-1的亲缘关系最近。     

一株猪源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性、耐药基因的检测

为了确定发病母猪组织是否感染病原菌及调查病原菌耐药情况,试验对发病母猪组织进行细菌分离培养,经过培养观察、生化试验、16S rRNA测序确定分离菌株,对分离菌株进行药敏试验、小鼠致病性试验、耐药基因检测、常见血清型分型及毒力基因检测。结果表明:分离得到一株肺炎克雷伯氏菌。分离菌株的16S rRNA测序结果与NCBI上18株肺炎克雷伯氏菌参考菌株序列同源性均在99%以上。分离菌株接种在血琼脂培养基上会发生α溶血现象,且具有多重耐药性,携带四环素类tet耐药基因,氨基糖苷类aph(3′)-Ia、strA、strB耐药基因,磺胺类sul 1、sul 2耐药基因及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因blaSHV,与耐药表型结果一致。分离菌株血清型分型为K20型,含有ureA、wabG、uge毒力基因。在小鼠致病性试验中,以浓度为6.15×10~8cfu/mL的菌液进行攻毒,能够使小鼠在22 h内死亡,表明分离菌株对小鼠具有致病性。说明本试验所分离得到的猪源肺炎克雷伯氏菌具有严重的耐药性和强致病性。     

猪葡萄球菌感染裸鼠及BALB/c小鼠模型的研究

用一株本室分离鉴定能够引起猪渗出性皮炎的猪葡萄球菌(S.hyicus GZ1)经肌肉注射裸鼠和BALB/C小鼠,意图研究裸鼠和BALB/C小鼠对猪葡萄球菌的易感性及猪葡萄球菌对裸鼠和BALB/C小鼠的致病性。结果表明裸鼠和BALB/C小鼠均可被感染,并表现各自的临床症状。裸鼠在感染后2到3d背部和面部皮肤开始出现大量小的红色囊泡,4到5d后部分囊泡消失,部分形成结痂。一些裸鼠眼睛还会有较多脓性分泌物渗出,感染两周后相继死亡。BALB/C小鼠感染该菌后多表现急性临床症状,感染后2到3d就相继死亡,因此表现不出明显的眼观病变,只有很少一部分小鼠皮肤上会出现炎性渗出,导致该处皮肤脱落。研究表明:BALB/C小鼠比裸鼠对猪葡萄球菌更易感,裸鼠感染后产生清晰可见的临床症状,而BALB/C小鼠在感染后往往还来不及表现明显的临床症状就相继死亡。可见,猪葡萄球菌不仅对猪有致病性,对裸鼠和BALB/C小鼠也都表现出不同程度的致病性。     

重庆市某肉牛场牛支原体肺炎的诊断

重庆市某肉牛场新进育肥牛群发生以呼吸系统感染为主的传染性疾病,为确诊病因,对表现明显临床症状的病牛进行迫杀,无菌采集肺脏、肝脏、血液和心肌进行病原分离,共分离到4株菌,分别编号为CQ1、CQ2、CQ3、CQ4.经16S rRNA序列比对,CQ1与牛支原体同源性达99.9％,CQ2与羊创伤球菌同源性达99.8％,CQ3、CQ4分别与大肠杆菌和沙门氏菌同源性达99％.通过培养特性、菌落形态观察、牛支原体特异性引物PCR扩增,确定CQ1为牛支原体;药物敏感性试验和动物试验表明,该分离株对环丙沙星、氧氟沙星、四环素、壮观霉素敏感,不致死小白鼠.按牛支原体肺炎临床用药后,疫情很快得到控制,结合实验室检测结果,确认该场爆发的是以牛支原体感染为主的牛支原体肺炎.     

Differential Diagnosis of Avian Reovirus and Pasteurella Mixed Infection in Broiler

In December 2014,a group of 4 weeks old broilers died in a large-scale chicken farm in Hebei province.The clinical symptoms of the ill and diseased chicken were depression,dyspnea,joint swelling and claudication.In order to diagnose the disease,a systematic analysis was conducted by laboratory diagnostic methods that included histopathological observation,bacterial isolation,PCR detection,drug sensitive test and animal pathogenicity experiment.The histopathological observation results showed that hemorrhage in the lung,the edema of heart and liver,a large number of heterophil granulocyte infiltration.Bipolar stained brevibacterium was observed under the microscopy.The PCR amplification results of Pasteurella multocida KMT-1 gene and avian reovirus σB gene were positive by using specific primers.The isolated Pasteurella could be lethal to mice and the isolate was highly sensitive to ceftriaxone and cefoperazone.Combination with the above laboratory test results and the clinical symptoms,we confirmed that the cases were mixed infection of avian reovirus and Pasteurella.     

肉鸡禽呼肠孤病毒与巴氏杆菌混合感染的鉴别诊断

2014年11月河北某规模化鸡场一批4周龄左右的肉鸡发病死亡,临床表现为精神沉郁、呼吸困难、关节肿大、跛行等症状,为对此疫病进行确诊,通过病理组织学观察、细菌分离、PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等实验室诊断方法进行系统分析。病理组织学观察结果显示肺脏出血,心脏、肝脏水肿,并伴有异嗜性粒细胞浸润;镜检可见两极深染的短杆菌;用多杀性巴氏杆菌KMT-1基因和禽呼肠孤病毒(ARV) σB基因特异性引物的扩增结果均为阳性;该巴氏杆菌分离菌可致死小鼠,且对头孢曲松、头孢哌酮等药物高度敏感。根据上述实验室检测结果并结合临床症状进行综合分析,最终确诊该病为ARV和巴氏杆菌混合感染。     

Pathogenicity of Bordetella bronchiseptica isolated from apparently healthy rabbits in guinea pig,rat, and mouse

Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) is associated with respiratory tract infections in laboratory animals. In our laboratory animal facility, B. bronchiseptica was isolated from 21 of 27 apparently healthy rabbits obtained from a breeding farm contaminated with B. bronchiseptica. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis showed that the flagellin genotype of isolates from the laboratory animal facility and breeding farm was type A, which is seen relatively frequently in rabbits in Europe. To examine its pathogenicity, guinea pigs, rats, and mice were inoculated intranasally with a representative strain isolated in the laboratory animal facility. Following inoculation of 10⁷ colony forming unit (cfu), severe inflammation was observed in the lungs of guinea pig and mice, although the inflammation was less severe in rats. The strain was recovered from the trachea and lungs of these species after inoculation with lower dose such as 10³ or 10⁴ cfu. These results suggest that the isolated strain causes respiratory tract infection in guinea pigs, rats, and mice, and that its pathogenicity higher in mice than in rats. This study extends our knowledge of interpreting the microbiologic status of laboratory animals, which will contribute to the development of reliable and reproducible animal experiments.     

苜蓿种带真菌及其致病性测定

对来自我国新疆,内蒙古,吉林,陕西,甘肃,宁夏,山东,黑龙江,山西,河北和江苏等１１个省（自治区）苜蓿产区的３０个审定登记品种的３８个苜蓿种子样品进行了系统的种带真菌检测研究;测定了２１种２５个真菌分离物对苜蓿幼苗根组织的入侵性及１９种真菌对苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响。     

互助藏羊梭菌病病原体的分离鉴定与分析

青海省互助县某羊场藏系绵羊患病死亡,伴有腹泻、神经症状,为快速确诊发病原因,及时防控和治疗,采集病羊样品5份,通过镜检、细菌分离培养、分子生物学试验及致病性试验进行病原鉴定分析。结果证明此次病原菌为羊致病性D型魏氏梭菌,毒素基因分析显示该菌同时含有α和ε两种毒素基因,动物致病性试验结果表明该菌对昆明系小鼠具有较强的致病性,并从试验致死的小鼠中分离到与藏羊病原相一致的细菌。三种基因的遗传进化树显示,该菌具有较强的多样性。研究确定了本次藏羊致死的主要病原为D型魏氏梭菌,结果可为该羊场梭菌病的治疗和预防提供科学依据。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D_{450 nm}值及P/N值选择1：20000稀释的5C10作为包被抗体,1：40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。     

犬猫皮肤病细菌性病原分离鉴定及天然产物抑菌效果分析

【目的】 分离鉴定武汉市患皮肤病犬猫细菌性病原,并探索其对传统抗菌药物与天然活性产物藤黄酸(GA)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)的敏感性。【方法】 对患皮肤病犬猫采样并分离病原,通过生长特性观察、革兰氏染色镜检、PCR等方法鉴定并利用SPF小鼠验证致病性;通过药敏纸片验证其对传统药物的耐药性,并测定天然产物对其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。【结果】 分离得到2株金黄色葡萄球菌、3株伪中间型葡萄球菌、2株猫葡萄球菌、1株犬链球菌及1株奇异变形杆菌。SPF小鼠皮肤创伤感染验证分离菌株均有致病性。犬链球菌及奇异变形杆菌对各自受试药物均敏感;葡萄球菌对复方新诺明、青霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星、苯唑西林、庆大霉素、克林霉素及氯霉素存在不同程度耐药。天然活性产物GA和BIO对上述9株菌均具有良好抑菌效果,且除分离菌株F5外GA对分离菌株的MIC值均小于BIO。【结论】 本研究共分离得到5种、9株犬猫皮肤细菌。犬链球菌、奇异变形杆菌对传统抗菌药物均敏感,部分葡萄球菌存在耐药。GA和BIO对犬猫皮肤病原菌均有明显抑菌活性,显示其可作为防控犬猫细菌性皮肤病的候选药物。     

Thermal characteristics of Metarhizium anisopliae isolates important for the development of biological pesticides for the control of cattle ticks

Experiments were conducted to determine if Metarhizium anisopliae isolates which are capable of growth at cattle surface temperatures could produce pathogenicity to Boophilus microplus in laboratory and field studies. The diurnal temperature fluctuation on the surface of cattle was monitored. The temperature tolerance of M. anisopliae isolates (ARSEF3297 and IMI386697) was determined and their pathogenicity to B. microplus compared at a standard bioassay temperature (28 degrees C) and at a temperature similar to the cattle surface (31-35 degrees C). The effect of the two isolates on the B. microplus population on cattle under field conditions was determined. The temperature of the fore udder, rear udder, ribs and neck regions of the mixed Holstein cattle fluctuated between 30 and 35 degrees C, in a similar pattern to the prevailing environmental temperature. However, wider fluctuations were obtained on the ears (28-35 degrees C) and spine (30-41 degrees C). The colony radius of both isolates declined as temperature increased, however, the growth of IMI386697 was five times greater than ARSEF3297 at 34 degrees C. At 28 degrees C, the pathogenicity of both isolates to B. microplus was similar, however, at 31-35 degrees C, IMI386697 was more pathogenic than ARSEF3297. Both isolates reduced the B. microplus population on cattle in comparison to the control formulation. However, IMI386697 (8.5+/-0.64 ticks/animal) produced a greater reduction in tick numbers than ARSEF3297 (19.1+/-0.64 ticks/animal). M. anisopliae was re-isolated from 8.9% of the ticks collected from IMI386697 treated cattle as compared to 2.8% of ticks from ARSEF3297 treated cattle.