蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1cm×1cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880bp(包括5′侧翼区2 262bp、CDS区1 260bp、3′侧翼区358bp),编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5′侧翼区存在潜在的启动子区域(-86~-336bp),且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITFM基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋(33.66%)、β折叠(16.66%)和无规卷曲(49.68%)组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性(89.1%),说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

北极狐CBD103基因序列生物信息学分析及启动子预测

为了研究北极狐CBD103基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、CBD103基因编码蛋白结构及功能,同时探究该基因的表达调控机制,试验通过RT-PCR扩增及测序技术从北极狐皮肤组织中获得CBD103基因cDNA序列,并利用生物信息学方法对所得序列进行预测分析。结果表明:获得序列全长2 327 bp(包括5'侧翼区2 071 bp、CDs区204 bp、3'侧翼区52 bp),编码67个氨基酸残基。北极狐CBD103基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域和CpG岛,且发现GC框、TATA框、CAAT框等调控元件及Sp1、Ets、Mef-2、ERE、Myc等多种转录因子。CBD103基因编码的蛋白是定位于细胞核和线粒体的不稳定疏水性蛋白质,此蛋白无规卷曲所占比例较大,使得蛋白构象多样化,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近。说明CBD103基因在不同物种间具有一定的保守性,且各物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,同时符合动物分类学。     

北极狐酪氨酸酶基因cDNA序列分析及启动子预测

为了探明北极狐酪氨酸酶(tyrosine,TYR)基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,通过RT-PCR扩增及基因测序技术首次从北极狐皮肤组织中获得TYR基因c DNA序列,全长4 300 bp(包括5'侧翼区2 681 bp,CDS区1 593 bp,3'侧翼区26 bp)。生物信息学分析结果表明:北极狐TYR基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域,并发现TATA框和CAAT框等调控元件及髓细胞增生原癌基因(Myc)、胰十二指肠同源盒1(Pdx1)、V-Myb髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(Myb)、E26转录因子1(Ets1)、特异性蛋白1(Sp1)和TATA盒结合蛋白(TBP)等多种转录因子。北极狐TYR基因编码蛋白的长度为530个氨基酸残基,编码蛋白是定位于生物膜上的不稳定可溶性亲水蛋白质,该蛋白以无规卷曲为主,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与其他物种的系统进化树分析提示北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近,不同物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,符合动物学分类。     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

蓝狐与银狐褪黑激素受体1A基因的克隆及序列分析

根据其它物种褪黑激素受体（melatonin receptor, MTNR）1A基因核酸序列的同源性设计引物,PCR扩增蓝狐和银狐MTNR1A基因的546 bp DNA序列,GenBank登录号分别为EU170442和EU170443。蓝狐和银狐MTNR1A基因DNA序列同源性为99.1%,编码的氨基酸同源性为99.4%,与人、鼠及绵羊MTNR1A基因同源性为84%~86%,与鸡MTNR1A基因同源性为74%。     

水牛甲状旁腺素基因克隆与生物信息学分析

本研究参考黄牛甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）基因序列设计引物,运用PCR扩增技术对水牛PTH基因进行克隆,并用生物信息学方法对序列进行分析。结果显示,成功克隆了水牛PTH基因完整编码区序列（CDS）348 bp,可编码115个氨基酸。该基因编码区序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为99%、93%、91%、97%、96%和92%,表明PTH基因在不同物种间高度保守。系统进化树分析表明,水牛与黄牛PTH基因亲缘关系最近。此外,在水牛PTH基因CDS上共发现了3个碱基突变,其中两个属于同义突变,一个属于错义突变。氨基酸序列分析表明,该蛋白属于碱性、亲水、稳定型蛋白质,其分子式为C₅₇₀ H₉₄₁ N₁₆₇ O₁₆₄ S₈,分子质量为13.01 ku。二级结构分析显示,水牛PTH蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主,与三级结构预测结果相一致。亚细胞定位分析显示,水牛PTH蛋白分布在细胞质（26.1%）、线粒体（21.7%）、细胞外（包括细胞壁）（17.4%）、内质网（13.0%）、细胞核（8.7%）、高尔基体（4.3%）和其他部位（8.7%）,推测PTH蛋白可能在运输、结合及细胞被膜等方面发挥信号转导和转录调控作用。     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。     

银黑狐MC1R基因核心启动子区的鉴定

【目的】确定银黑狐黑素皮质激素受体1（melanocortin 1 receptor，MC1R）基因的核心启动子区，为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。【方法】以银黑狐基因组DNA为模板，PCR扩增获得MC1R基因5'-UTR区序列，利用3个在线生物学软件综合预测MC1R基因启动子活性区；PCR扩增获得该基因5'-UTR区不同长度的缺失片段，并克隆至pMD19-T载体，将重组质粒转染至黑色素B16细胞中，利用双荧光素酶检测技术对10个缺失片段进行荧光素酶活性检测。【结果】成功获得银黑狐MC1R基因5'-UTR区序列，软件预测显示－596/＋73 bp可能为启动子活性区。双荧光素酶活性检测发现，构建的10个缺失片段的荧光素酶表达载体均具有启动子活性，其中pGL3-MC1RP8（－520/＋73 bp）有较强的活性，提示其为核心启动子区，与软件预测结果基本一致。【结论】试验确定了银黑狐MC1R基因的核心启动子区为―520/＋73 bp，为深入研究该基因的毛色调控机制奠定了理论基础。     

野桑蚕、家蚕LSP基因5''''侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP,基因5’侧翼区,约1.9kb,并进行了序列测定与分析。结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5’上游区;野桑蚕LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP,基因5’侧翼区的同源性达96.4％,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6％,100％;家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP基因5’侧翼区的同源性达98.9％,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100％,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5’上游区(-304～598bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7639～7933bp)的同源性达90.6％,-913～-1383bp为失活的部分水手转座子元件。     

猪SP-A基因启动子区的克隆与序列分析

为了探明猪SP-A基因的启动子及其转录调控机制,设计6条特异性引物,采用染色体步移、克隆测序以及序列比对分析,从大白猪基因组中扩增出一段长度为1 033 bp的猪SP-A基因的上游序列(DQ985806),其GC含量约为55%.经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-33 bp处存在1个TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box、GT-box以及转录起始子;该序列还包含Spl、TF和NF-κB等转录因子结合位点以及1个特殊重复序列5'-CATCACTGT-3'.上述试验结果表明,所克隆的1 033 bp的DNA序列是大白猪SP-A基因的启动子区序列.     

牛GDF5基因启动子的克隆与序列分析

旨在了解生长分化因子5(GDF5)可能的调控序列。本研究通过基因组比对,扩增了牛GDF5基因5′侧翼区,并通过产物纯化、连接、转化及测序比对,确定了2043bp的启动子序列。同时综合考虑已经证实的人GDF5基因启动子结构及应用启动子在线分析软件,对该序列进行分析。结果发现,牛GDF5基因5′侧翼区没有CpG岛,序列比对发现,牛和人GDF5基因启动子区域同源性为78%;牛GDF5基因启动子没有TATAbox或CAATbox结构,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-359bp位置,其潜在的转录因子有AML-la,Ap-1,AmL-la,CdxA,SRY,CdxA,TATA,AmL-la,GTATA-1,MZF1,CdxA,Nkx-2,CdxA,S8和SRY,其中Ap-1,AmL-la,SRY,Nkx-2,S8和SRY高度保守,与人的序列完全一致;推测发现牛GDF5基因启动子-457至-423bp序列中的GT重复序列可以增强启动子的活性,且最小增强子处于-458和-377bp之间。研究结果推测判定了牛GDF5基因启动子的转录起始位置、转录结合位点、活性序列及最小增强子序列,为以后深入研究GDF5基因在牛软骨细胞中的表达机制提供了理论基础。     

山羊MyoG基因启动子区序列分析与结构预测

为探明山羊MyoG基因的启动子序列与结构及转录调控机制,本研究设计了1对引物,采用PCR扩增、测序以及序列比对分析,从波尔山羊基因组中扩增出一段长度为969bp的山羊MyoG基因的5′侧翼序列,其GC含量为50.6%。经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-24bp处存在1个TATA-box,另外还发现了1个GC-box、2个CAAT-box、2个E-box和1个富含A-T碱基的模体结构;该序列还包含HSF、ADR1和cap等转录因子结合位点。通过比对分析,所得山羊MyoG基因5′侧翼序列与牛、马鹿、人、小鼠和鸡同源序列的相似性在37.22%～96.85%之间,说明不同物种间该序列具有一定的保守性。本研究为进一步探讨山羊MyoG基因的表达和调控机制奠定了理论基础。     

鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白基因启动子活性分析

PCR扩增鸡L-FABP基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,进行克隆并测序,构建了鸡L-FABP基因报告基因系列缺失载体,瞬时转染进入人肝癌细胞系,利用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性。在线分析软件发现鸡L-FABP基因启动子区存在HNF-1、SREBP-1、AP-1、C/EBP、Oct-1、TATA、CCAAT、GATA-1等调控元件,没有发现CpG岛。报告基因结果表明鸡L-FABP基因启动子-2 076bp/-20bp区域具有最强的启动子活性,-522bp/-20bp区域启动子活性最弱;C/EBPα可以显著的抑制鸡L-FABP基因的表达,这些结果为深入研究鸡L-FABP的表达调控机制奠定了基础。     

几个中外猪种H-FABP基因启动子区遗传变异分析

利用7个中国地方猪种、2个西方商业品种及1头东北野猪,通过设计2对引物,采用测序的方法研究猪心脏型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）基因启动子区1553 bp多态性,结果发现,在该基因启动子区存在18个SNPs位点,位点间的平均遗传距离为81.7 bp,其中江海型猪的多样性最低（0.18%）,华北型猪种多样性最高（0.34%）;NJ进化树分析结果发现,地域相近的猪种并不能完全聚在一起。本研究结果为进一步研究H-FABP基因与肉品质性状的关联性奠定了基础。     

犬和北极狐白细胞介素-2基因的克隆及序列分析

为了给制备犬和狐白细胞介素-2相关免疫治疗剂、免疫增强剂提供材料,并且为构建插入犬和狐白细胞介素-2基因表达盒的新型基因工程疫苗提供物质基础,从犬、北极狐两种犬科动物基因组中克隆白细胞介素-2,经测序验证扩增片断长度为580 bp,包含全部编码序列和两侧非翻译区。序列分析表明犬与狐核苷酸序列同源性都超过99%,氨基酸序列完全一致。     

一个新的家蚕锌指蛋白基因的克隆及基因组结构分析

锌指蛋白是一类能与细胞内核酸特异结合 ,调控基因表达活性 ,对细胞分裂、分化、胚胎发育及个体生长有重要作用的转录因子。从家蚕 5龄丝腺组织cDNA文库中克隆了一个具有锌指结构的新基因 ,命名为BmZFP基因 (GenBank登录号 :AY75 36 5 9) ,其cDNA全长为 180 9bp ,编码 14 3个氨基酸 ,3′端非翻译区 (3′ untranslatedregion ;3′ UTR)达 1332bp碱基序列。BmZFP氨基酸序列推测有 6个功能结构域 ,是一种CCHC型锌指蛋白。虽然BmZFP氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白的氨基酸序列同源性只有 33%左右 ,但 6个功能域中的Cys(C)和His(H)却完全匹配 ,推测其功能与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白有相似性。BmZFP基因序列的结构分析表明 :该基因由 2个外显子和 1个 14 86bp碱基序列的内含子组成 ,在 5′端上游 - 182～ - 2 2 2区域存在一个启动子元件 ,但不是典型的TATA盒启动子。