广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

民猪耳皮成纤维细胞分离培养及生物学特性

为了研究民猪耳皮成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以1日龄民猪耳皮组织为试验材料,细胞原代培养采用组织块贴壁法,成纤维细胞纯化采用胰酶消化法和差速贴壁法,建立民猪耳皮组织成纤维细胞系,同时将细胞液氮冷冻长期保存。结果表明,成纤维细胞生长曲线呈"S"形,冻存前后活率均在90%以上。该试验成功建立了民猪成纤维细胞体外分离和培养方法。     

东北野猪耳皮成纤维细胞系的建立及生物学特征

研究了东北野猪耳皮组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特性,并对培养细胞进行了污染检测及冷冻保存和复苏培养观察.结果显示:原代培养在接种5d组织块边缘开始游离出单个细胞,到10d细胞生长旺盛;用酶消化法和差速贴壁法得到纯化的东北野猪成纤维细胞;冷冻前和复苏后的细胞活率分别为96.7％和92.7％,差异不显著(P＞0.05);分离纯化的东北野猪成纤维细胞生长曲线正常;支原体和病毒检测呈阴性;成功建立东北野猪成纤维细胞系.     

藏野驴皮肤成纤维细胞分离培养及生物学特性分析

为了研究藏野驴成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以7岁龄藏野驴耳部皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行细胞原代培养,采用胰酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,通过细胞形态观察、生长曲线测定、细胞周期和免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果显示,成纤维细胞生长曲线呈“S”形,细胞生长状态良好,细胞特异性标记免疫荧光染色显示FSP-1呈阳性表达。结果表明,成功建立了藏野驴成体耳部皮肤成纤维细胞体外分离、培养和鉴定方法,为藏野驴种质资源保护、细胞水平及分子水平的研究奠定了基础。     

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13 d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体（2n=38）占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体（Lipofectamine^TM 2000）转染绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。     

鲁西黄牛皮肤成纤维细胞分离与培养的研究

研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的分离与培养、纯化方法及生长特征,获得了传代培养的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞和上皮细胞.鲁西黄牛耳皮肤细胞在体外培养时呈贴壁生长,其原代或早期传代培养物由上皮样细胞与成纤维细胞混合组成.传代培养混合生长的细胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化处理3～4 min,脱壁悬浮的主要为成纤维细胞.采用反复消化法在传代过程中将二者逐步分离纯化,获得了可正常传代的鲁西黄牛耳上皮细胞系和成纤维细胞系.通过绘制生长曲线研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的增殖规律.传代培养至12代的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞染色体倍性正常.利用第6代成纤维细胞作核供体克隆试验结果证明重构胚体外发育正常,囊胚发育率为27.3%.     

鸽胚胎成纤维细胞系的构建及生物学特性研究

(目的)为了研究鸽肌肉发育特点,本试验采用组织贴壁法成功培养白羽王鸽成纤维细胞系。(方法)本研究选用白羽王鸽第10日龄胚胎的腿部肌肉组织,采用组织块贴壁培养法进行原代细胞培养,在原代培养第3天开始进行细胞计数,建立其生长曲线,通过细胞冻存和复苏分析细胞活力。(结果)结果表明,贴壁后的细胞呈特征的梭型,多星型,彼此间紧密连接,生长状态良好,细胞生长曲线呈"S"型。细胞复苏率达到80%以上。(结论)通过组织块培养法,已成功建立白羽王鸽鸽胚的成纤维系,为深入研究与鸽肌纤维发育相关的基因功能提供良好的实验平台。     

不同年龄二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性

采用胶原酶消化法建立细胞系,观察细胞形态、测定细胞冻存前和复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线,并对染色体核型进行分析,研究不同年龄的二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性,分析年龄对二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞体外培养的影响。试验结果表明,年龄对细胞形态无影响;冻存没有降低细胞的存活率(P0.05);细胞的生长曲线呈典型的S型且年龄对细胞的生长无明显影响(P0.05);染色体核型分析显示,不同年龄的山羊耳组织成纤维细胞系的染色体数目均为2 n=60(XY/XY),无染色体畸形。说明不同年龄,甚至年龄比较大的二狼山绒山羊个体(13岁)都可以通过胶原酶消化法建成稳定的成纤维细胞系,本试验使二狼山绒山羊种质资源在细胞水平得到保存,为二狼山绒山羊成纤维细胞系的建立以及开展其种质资源的保存提供一定的参考。     

撒坝猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

实验采用撒坝猪耳缘组织块贴壁培养法首次对撒坝猪成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了撒坝猪耳缘成纤维细胞系;并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行分析;还利用透射电镜观察了耳缘组织细胞。结果表明:细胞倍增时间为48 h,生长曲线为"S"型;染色体中正常二倍体染色体(2n=38)所占比例为92.56%;细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染检测均显示为阴性。透射电镜观察显示,成纤维细胞呈长梭型。     

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法（0.25%胰酶处理1 h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6 h）培养驴皮组织3 d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15 d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。     

Study on in vitro Culture of Donkey Skin Fibroblasts

This study was aimed to compare different culture methods for donkey skin fibroblasts to establish a highly efficient and rapid culture system. The dermal tissue of the healthy and 6-7 year old Xinjiang donkey was cultured for primary cells of skin fibroblast with tissue explants adherent method and double enzyme digestion method. Then,the growth characteristics,proliferation,cell cycle and mycoplasma contamination were detected and analyzed. The results showed that the fibroblast cells entered the logarithmic growth phase after cultured for 3 days by double enzyme digestion(0.25% trypsin digestion for 1 h and then 0.5% collagenase Ⅰ for 6 h), while it required 15 days with tissue explants adherent method. Flow cytometry analysis showed that nearly half of the cells were in G0/G1 stage,the other half in S+G2+M stage, while just 5.17% of the cells were apoptosis,which indicated that most of the cells were in the active stage of division and proliferation,and had strong vitality. Moreover, there was no mycoplasma contamination in the cultured cells. In summary,the culture system of donkey skin fibroblasts was rapidly and effectively established with the double enzyme digestion method in vitro.     

晋中绵羊耳成纤维细胞系建立

以晋中绵羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法,通过原代培养和传代培养对细胞进行了细胞形态学观察、细胞计数和生长曲线的绘制,探讨了细胞体外培养模式.结果:细胞生长总体趋势呈“S”型;建立了晋中绵羊耳成纤维细胞系,细胞系的建立,使晋中绵羊的重要种质资源在细胞水平上保存下来.     

In vitro Culture and Identification of Ear Marginal Fibroblast Cell Lines Derived from Mashen Pigs

In order to study the biological characteristics of somatic cells of Mashen pig, the ear marginal fibroblast cell lines of Mashen pig were established from 3 days old Mashen pig by direct explant method,and the biological characteristics of cell lines were detected. The results showed that the cell lines obtained from Mashen pig were in conformity with basic properties of typical fibroblasts, the shape of adherent cells were typical spindle, star and polygon, the time of grew into monolayer cells was 10 to 13 d, the growth curve was typical S shaped. The frequency of metaphase chromosome number (2n=38) was about 84% of the total number of cells, and it had met the establishment standard of fibroblast cell line. The transfection efficiency of green fluorescent protein(pEGFP-C1)transfected by lipofectamine-mediated method was 25%. The successful establishment of the fibroblast cell lines of Mashen pig had opened up a new method for the conservation of genetic resources.     

Establishment and Identification of a Fetal Fibroblast Cell Line with Double Transgenic (pGH/IGF-Ⅰ) Porcine

This study was aimed to establish a fetal fibroblast cell line of double transgenic (pGH/IGF-Ⅰ) pigs,and reserve fibroblast cells of double transgenic pigs for the follow-up study.A method of trypsin digestion was adopted to isolate and culture body tissues from pregnant porcine,and porcine fetal fibroblasts were isolated successfully through primary culture,subculturing and cryopreservation.The morphological observation,determination of viability before cryopreservation and after recovery,dynamic growth analysis,vimentin immunohistochemistry and microbial contamination detection were all done to study the biological characteristics of the cell line.The results showed that the fibroblasts were cultured and isolated successfully by trypsin digestion and differential centrifugation.The cell viability before cryopreservation and after recovery were 94.3% and 91.2%,respectively.The growth curve was sigmoidal,and experienced the incubation period,exponential growth period and platform three stages.The vimentin immunohistochemistry was positive,the microbial contamination detection were all negative.The results indicated that a fibroblast cell line of double transgenic porcine was successfully established.     

转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

广灵驴HSL基因克隆、序列分析与差异表达

试验旨在对广灵驴的激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）基因进行克隆和序列分析，并对HSL基因在广灵驴不同组织中的差异表达水平进行分析。使用RT-PCR法扩增并克隆广灵驴HSL基因CDS区部分序列，将序列拼接后得到HSL基因完整的CDS区全长序列，并对序列进行一系列生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR检测HSL基因mRNA在广灵驴的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪7个组织中的表达情况。结果显示，广灵驴HSL基因完整的CDS区全长为2 286 bp，共编码761个氨基酸，序列已提交到NCBI，登录号：MN231003。广灵驴HSL基因的核苷酸序列与马、羊驼、骆驼、猪、牛、山羊、小鼠、绵羊相应序列的同源性分别为99.6%、88.9%、88.6%、88.1%、86.9%、85.6%、80.8%、79.1%。系统进化树预测表明，广灵驴HSL基因与马的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现，HSL蛋白的理论等电点为6.51，不稳定指数为56.83，亲水性的总平均值为-0.048，说明HSL是酸性不稳定的水溶性蛋白。蛋白保守域中存在N-末端结构域、α/β水解酶折叠结构域以及调节结构域。蛋白序列中共存在88个磷酸化修饰位点、25个糖基化修饰位点。蛋白中存在较强的疏水性区域，没有信号肽及跨膜区域。二级结构显示此蛋白是由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成的，分别占45.33%、11.70%、5.65%、37.32%。实时荧光定量PCR检测结果显示，HSL基因mRNA在广灵驴的7种组织中均有表达但存在差异，在皮下脂肪中表达量最高，在心脏中表达量最低，说明广灵驴HSL基因可能在体内脂肪沉积中发挥着非常重要的作用。该试验为进一步研究HSL蛋白功能及其在广灵驴脂肪沉积中代谢调控机制提供了理论基础。     

滩羊成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

试验以滩羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻保存技术构建了35个滩羊成纤维细胞系,并对其进行了形态学、生长动力学、细胞活力测定、核型分析、微生物检测和荧光蛋白报告质粒(PEGFP-N3)基因转染等生物学特性的研究。结果表明,细胞群体倍增时间(PDT)约为36h,细胞冻存后活力为95.8%,细胞染色体中二倍体(2n=54)占主体,镜检细胞的百分比约为97.5%。细菌、真菌、病毒和支原体检测结果为阴性,该细胞库的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准。