流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056bp,以包涵体的形式表达约40ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达与鉴定

参照已发表的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增长约972 bp的E基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白的可溶性表达与抗原性分析

为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。     

羊痘病毒063载体构建及蛋白纯化

为研究羊痘病毒宿主范围因子063基因的特征及其生物学功能,采用PCR方法扩增063基因,通过双酶切和基因同源重组的方法与PGEX-KG载体连接构建成融合表达GST标签的原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确的克隆转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达063蛋白,产物经SDS-PAGE电泳检测和Western Blot鉴定,大量诱导表达063蛋白,通过谷胱苷肽琼脂糖亲合层析法,得到063纯化蛋白。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

中国美利奴绵羊磷脂酶Czeta基因表达载体的构建及原核表达

构建美利奴绵羊磷脂酶 C zeta（PLCζ）融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化,为其特异性抗体的制备及生物学功能研究奠定基础。用 PCR 技术扩增出 PLCζ基因片段,亚克隆到原核表达载体pCzn1中,导入 Arctic Express TM （DE3）感受态细胞,IPTG 诱导表达,收样后进行 SDS-PAGE 电泳或Western blot 检验 PLCζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法大量纯化融合蛋白。结果显示,重组质粒经 PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确。pCzn1表达载体在 Arctic Express TM （DE3）表达菌中能很好地表达融合蛋白。表达纯化后可获得了分子量约74 ku 的融合蛋白,符合预期大小。成功构建 pCzn1-PLCζ原核表达载体,表达并纯化了其融合蛋白,Western blot 试验表明其蛋白分子的完整性良好,这将有利于对 PLCζ蛋白进行深入的研究。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白亚单位疫苗制备及其免疫效果评价

为制备乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)NS1蛋白亚单位疫苗并评价其免疫效果，将JEV NS1基因克隆至杆状病毒表达载体，构建重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染High5细胞，收集培养基上清，并用镍柱亲和方法纯化NS1蛋白。将纯化的NS1蛋白与弗式佐剂制成亚单位疫苗，并通过小鼠免疫接种和攻毒模型评价该疫苗的免疫效果。结果表明，50,100,200μg/只剂量的亚单位疫苗免疫组的保护率分别为70%,80%,90%;同时，较非疫苗免疫组，NS1亚单位疫苗免疫可以显著降低小鼠脑组织中的病毒载量和炎症因子的表达，减轻小鼠的神经症状和脑部病理损伤。以上结果表明NS1蛋白作为亚单位疫苗具有较好的免疫保护效果，具有开发为JEV新型疫苗的潜力。     

日本乙型脑炎病毒NS3蛋白的真核表达及鉴定

为了探讨日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机制及其蛋白与宿主蛋白的相互作用关系,试验以GenBank中收录的JEV HW1株NS3基因序列为模板设计引物,经PCR扩增获得NS3基因序列后,采用ClonExpress克隆技术将NS3基因连接到真核表达载体p EGFP-C3上,将得到的产物pEGFP-C3-NS3送生工生物工程(上海)股份有限公司测序;使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent体外转染幼地鼠肾细胞(BHK21细胞),观察24 h后应用Western-blot和IFA法进行鉴定。结果表明:PCR克隆获得的基因片段大小约为1 370 bp,NS3基因片段与HW1株同源性为100%; BHK21细胞密度在70%～80%时质粒转染效果最佳,质粒质量与转染试剂体积的比例为1∶3; Western-blot鉴定融合蛋白成功表达,分子质量约为79 ku; IFA鉴定融合蛋白成功表达,24 h为转染高峰期,绿色荧光最强,pEGFP-C3-NS3与NS3阳性血清反应显红色荧光。说明在BHK21细胞中成功表达出NS3蛋白。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

日本脑炎病毒NS1’蛋白移码片段的原核表达及免疫反应性分析

通过对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成1对引物,利用PCR扩增出NS1’移码片段,并将移码片段克隆入pET-32a表达载体中。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,经IPTG于20℃过夜诱导,实现了目的片段的可溶性表达。对表达产物进行SDS-PAGE鉴定,可检测到分子质量约为25 ku的融合蛋白。以日本脑炎病毒野毒株和弱毒株感染小鼠血清为一抗,进行Western blot分析,原核表达蛋白仅与野毒感染小鼠血清发生特异性反应,说明该蛋白具有区分临床野毒感染和疫苗免疫的潜力。     

猪日本脑炎DNA疫苗的构建与鉴定

为开发猪日本脑炎新型疫苗,采用PCR方法扩增日本脑炎病毒WHe株prME和NS1基因,并将其分别克隆至DNA疫苗载体pVAX1,分别用酶切和测序分析进行鉴定。结果表明prME和NS1基因大小分别为2.1kb和1.1kb,酶切和测序结果表明,猪日本脑炎DNA疫苗pVAX1-prME和pVAX1-NS1构建成功,为进一步免疫试验奠定了基础。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

日本脑炎病毒NS1基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA,用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-30b(+)中,转化大肠杆菌BL-21(DE3),经IPTG诱导,NS1基因获得高效表达.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46 000,重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%.Western blotting分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性.     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。