驴Zfy基因cDNA克隆及生物信息学分析

本研究旨在对驴Zfy基因的cDNA序列进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中公布的家牛Zfy基因mRNA序列(登录号:NM_177491.1)设计特异性引物,运用RT-PCR技术获取驴Zfy基因的cDNA序列,并对Zfy基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfy基因CDS区序列长度为2 325bp,编码774个氨基酸;蛋白质二级结构预测结果显示,Zfy蛋白没有信号肽及跨膜结构;驴Zfy基因CDS区序列与家牛、绵羊、人、家猫、家犬、马鹿、黑猩猩、藏羚羊的同源性分别为92.9%、92.6%、91.8%、93.8%、92.5%、92.3%、91.6%和92.6%;对驴和其他8种哺乳动物Zfy基因CDS区核苷酸序列构建的系统进化树显示,驴与绵羊、藏羚羊、家牛、马鹿亲缘关系较近,与家犬和家猫的亲缘关系稍远,与人和黑猩猩亲缘关系最远。本研究成功克隆出驴Zfy基因CDS区序列,为进一步研究驴Zfy基因的功能奠定了基础。     

马鹿Zfx/Zfy基因的克隆及序列分析

根据GenBank中公布的牛Zfx/Zfy基因的mRNA序列,设计特异性引物,对马鹿Zfx/Zfy基因进行扩增,并对该序列进行分析。结果表明,克隆得到马鹿Zfx基因序列长为2 115 bp,GenBank登录号为KP257294.1,编码696个氨基酸;Zfy基因序列长为2 406 bp,GenBank登录号为KU041539,编码801个氨基酸。依据Zfx/Zfy基因氨基酸序列构建进化树,分析表明,马鹿Zfx基因与人的亲缘关系较近,与聚为一类的野牛、藏羚羊、虎、家猫、家牛、家犬、绵羊的亲缘关系稍远;Zfy基因与家牛、野牛、藏羚羊、绵羊的亲缘关系较近,与其他动物及人的亲缘关系较远。本研究首次克隆了马鹿Zfx/Zfy基因,为研究该基因蛋白质的结构和功能奠定了基础。     

德州驴HO-1基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号：XM＿023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages, DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences, CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码...     

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列（登录号：D84097.1）设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点（pI）为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。     

阳原驴MSTN基因生物信息学分析及组织表达研究

【目的】试验旨在分析阳原驴肌生长抑制素(myostatin,MSTN)基因CDS序列特征及其在不同生长发育时期和不同组织中的表达水平。【方法】采集6、12、18、24月龄阳原驴的血样及不同组织样,提取其基因组DNA及不同组织样总RNA。利用PCR技术扩增阳原驴MSTN基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在阳原驴不同生长发育时期背最长肌、腿肌和18月龄不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)中的表达水平。【结果】阳原驴MSTN基因CDS序列长1 128 bp,编码375个氨基酸,与马的核苷酸序列相似性最高(99.9%),编码蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,含有转化生长因子-β(TGF-β)超家族结构域,不含跨膜区,存在1个信号肽区域,包含6个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和34个磷酸化位点,主要分布于细胞核中(39.1%),二级结构中无规则卷曲占比最高(50.93%)。MSTN基因在18月龄阳原驴背最长肌和腿肌中的表达水平显著高于6、12、24月龄(P＜0.05);MSTN基因在18月龄阳原驴不同组织中均有表达,其中背最长肌中的表达水平显著高于其他组织(P＜0.05),其次是腿肌、肺脏、脾脏、肾脏和肝脏,心脏中的表达水平最低。【结论】试验成功扩增出阳原驴MSTN基因CDS序列,MSTN基因在阳原驴不同生长发育时期背最长肌和腿肌中的表达水平均以18月龄最高,且在18月龄不同组织中以背最长肌和腿肌中表达水平较高。研究结果为进一步探讨MSTN基因在阳原驴骨骼肌生长发育中的作用机制提供参考。     

鹅ATP5E基因cDNA克隆及生物信息学分析

线粒体ATP酶合成体ε亚基(ATP synthase,H+transporting,mitochondrial F1 complex,epsilon,ATP5E)是ATP合成酶催化中心的最小亚基,在能量代谢过程中具有重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术获得鹅ATP5E序列,并结合生物信息学方法对鹅ATP5E的序列进行深入分析。结果表明:克隆获得鹅ATP5E基因序列全长为347 bp,包括156 bp的编码区序列,编码51个氨基酸。同源性分析发现,鹅ATP5E核苷酸序列与推测氨基酸序列与原鸡的同源性最高,分别达到87.74%和89.58%,而与其他物种之间的一致性差异稍大。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白理论分子量为水溶性蛋白,相对分子量为5.79 ku,理论等电点为10.01,无信号肽序列和跨膜区,预测含有4个磷酸化位点,二级结构以α螺旋为主,预测ATP5E蛋白主要在能量代谢和脂肪酸代谢过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨ATP5E基因在鹅肝脂肪变性过程中的功能研究奠定了信息基础。     

广灵驴CAPN1基因克隆、生物信息学分析及表达研究

本研究旨在对钙蛋白酶1（CAPN1）基因CDS区进行克隆及生物信息学分析,并鉴定其在广灵驴各组织中的表达量。应用生物信息学方法对广灵驴CAPN1基因CDS区进行序列分析,并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰结构和蛋白结构进行预测;利用实时荧光定量PCR技术对CAPN1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达水平进行分析。结果显示,广灵驴CAPN1基因CDS区全长2 148 bp,可编码715个氨基酸,已提交至NCBI,登录号为：MN158194,其核酸序列与马、绵羊、牛、人、山羊、小鼠、猪的同源性分别为99.7%、92.3%、92.5%、92.0%、92.5%、85.9%和92.9%;CAPN1蛋白的分子质量为82.01 ku,理论等电点为5.59,平均疏水性为-0.374,不稳定系数为36.42,不存在跨膜区及信号肽;其编码蛋白的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链组成;CAPN1基因在广灵驴的6种组织中均表达,其中在背最长肌中的表达量最丰富,其次是肝脏,在心脏中的表达最低。本研究成功克隆了广灵驴CAPN1基因CDS,并对其在不同组织中的表达量进行了分析,为进一步研究CAPN1基因在肌肉嫩度方面的表达调控功能及发展地方品种广灵驴肉制品产业提供了理论依据。     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

巴马香猪TLR2基因cDNA的克隆及生物信息学分析

利用NCBI公布的TLR2基因序列设计引物,RT-PCR克隆巴马香猪(Sus barbatus)TLR2基因。核酸序列分析表明,巴马香猪TLR2基因开放阅读框长2358bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为7.52,相对分子质量为89480;与普通猪比对发现,巴马香猪TLR2基因有15个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为73.4%,82.4%,59.5%,85.3%,84.6%,82.4%。TLR2膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在21～22位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有4个明显的LRR,分别位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸区;膜外区含6个N连接的糖基化位点。     

山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建

旨在对西农萨能奶山羊Zfy基因进行克隆和生物信息学分析,并利用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除Zfy基因的奶山羊成纤维细胞株,为进一步探索Zfy基因功能及性别调控提供基础数据.本研究以健康的西农萨能奶山羊为对象,采集3只3月龄公山羊睾丸组织并提取总RNA.根据NCBI中预测的山羊Zfy基因mRNA序列信息(Gen...     

牦牛死亡结构域蛋白(FADD)基因克隆与生物信息学分析

死亡结构域蛋白(FADD)是在生物细胞里起到信号转导作用的一种蛋白,在胚胎发育、细胞凋亡过程中发挥重要的生物学活性。实验以成年母牦牛的卵巢RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆牦牛FADD基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:牦牛FADD基因CDS区长度630 bp,编码209个氨基酸,蛋白分子式C996H1632N300O307S7,整个蛋白质带负电荷,总共原子数量3 242;分子质量23.0 ku,半衰期30 h;理论等电点6.11;消光系数18 240;不稳定指数49.08,属于不稳定蛋白;脂肪系数104.64,平均亲水系数-0.168,预测FADD蛋白为亲水蛋白。系统进化树表明,牦牛与哺乳动物亲缘关系近,与鱼亲缘关系最远,符合物种进化规律。FADD蛋白质的二级结构α螺旋、自由卷曲、β-转角和延伸链,占靶蛋白的比例分别为71.29%、22.97%、3.83%和1.91%,与三级结构相符。牦牛FADD蛋白有13.0%位于细胞核、52.2%位于细胞质、8.7%位于细胞外、13.0%位于线粒体、4.3%位于高尔基体和8.7%位于细胞骨架。该研究成功克隆出牦牛FADD基因CDS区,为进一步研究其功能提供了一定理论依据。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

玻璃化冻存对驴卵母细胞超微结构的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响,寻求驴卵母细胞冷冻的最佳条件。通过对不同发育时期的驴卵母细胞进行玻璃化冷冻,冷冻复苏后分别进行成熟培养和孤雌激活,并对GV期未冷冻组（对照组）、GV期冷冻组、IVM-M Ⅱ冷冻组卵母细胞微丝和线粒体超微结构进行免疫荧光标记,统计冷冻复苏后卵母细胞形态正常率、成熟率、孤雌激活卵裂率、超微结构正常率。结果表明,GV期冷冻组卵母细胞的形态正常率与GV期未冷冻组（对照组）间无显著差异（P>0.05）,成熟率和卵裂率均显著低于对照组（P<0.05）;IVM-M Ⅱ冷冻组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05）,且卵裂后细胞发育受到阻滞。冷冻组微丝在皮质区分布明显减少的卵母细胞数目增多,冷冻组卵母细胞的线粒体数量明显低于对照组,由此可以说明冷冻对卵母细胞超微结构有损伤,从而导致复苏后成熟率下降,影响卵母细胞的受精和体外发育,且GV期冷冻组较IVM-M Ⅱ冷冻组在微丝与线粒体结构上有较小损伤,发育状态较好。     

Cloning and Sequence Analysis of Zfx/Zfy Gene in Cervus elaphus

Specific primers were designed according to the mRNA sequence of Bos taurus Zfx/Zfy genes provided in GenBank.Zfx/Zfy sequences of Cervus elaphus were cloned and analyzed.The results showed that the cloned Zfx gene sequence of Cervus elaphus was 2 115 bp (GenBank accession No:KP257294.1) that encoded 696 amino acids,the cloned Zfy gene sequence was 2 406 bp (GenBank accession No:KU041539) that encoded 801 amino acids.The phylogenetic trees of Zfx and Zfy amino acid were obtained using the Neighbor-Joining method of DNAStar software.Analysis showed that Zfx of Cervus elaphus was closely related to Homo sapiens,compared with Bison,Pantholops hodgosoniiand,Panthera tigris,Felis catus,Bos taurus,Canis lupus familiaris,Ovis aries.Zfy of Cervus elaphus was closely related to Bos taurus,Bison,Ovis aries,Pantholops hodgosonii compared with others.Zfx/Zfy genes of Cervus elaphus were cloned and sequenced for the first time,and this research provided a foundation for further studying the structure and biological functions of the proteins.     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。