从光合作用和有机酸积累角度探索转GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐碱性增强的生理机制

光合作用影响着植物的生长发育及产量,并在盐碱胁迫响应中起到积极作用。前期研究将光合途径中野生大豆来源的GsPPCK1和GsPPCK3基因转入苜蓿,所获得转基因苜蓿耐碱性提高。从光合作用和有机酸积累角度探索转GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐碱性增强的生理机制。结果表明,碱胁迫9d后,叶绿素的相对含量下降,转基因株系P1-5、P3-8与未处理相比变化并不显著,分别下降了11.27%、13.30%,而非转基因株系的叶绿素含量下降了39.11%。转基因株系P1-5、P3-8光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)及胞间CO2浓度(Ci)在胁迫处理后也有下降趋势,但下降的幅度仅为非转基因植株下降幅度的1/2。光合途径中NADP-苹果酸脱氢酶、NADP-苹果酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸正磷酸二激酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等关键酶的酶活及有机酸(苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸)含量在碱胁迫处理后均呈上升趋势,而转基因株系P1-5、P3-8的光合酶活和4种有机酸含量与非转基因对照相比上升极显著(P0.01)。PEPC(Medtr4g079860.1)、NADP-ME(Medtr8g014390.1)、NADP-MDH(Medtr1g043040.1)、PPDK(Medtr4g118350.1)及Rubisco(Medtr4g021210.1)基因的表达呈先上升后下降趋势,转基因株系中基因的表达变化较非转基因对照更为显著(P0.01)。由此表明,在正常情况下,GsPPCK1和GsPPCK3基因的超量表达并未影响植物的光合作用,但是在碱胁迫下,转基因苜蓿的光合作用受碱胁迫的抑制较小,这一过程可能与PEPC酶的激活有关。另外,光合中间产物有机酸含量的显著上升对维持细胞内pH值的稳定也起到重要作用。     

添加有机酸对苜蓿青贮营养品质的影响

[目的]为了探讨添加有机酸对苜蓿青贮营养成分的影响.[方法]设六个处理,分别添加甲酸3 mL/kg、6 mL/kg,甲酸、乙酸(1∶1)3 mL/kg、6 mL/kg,甲酸、乙酸(3∶7)3 mL/kg、6 mL/kg,采用塑料袋青贮.[结果]表明各组添加有机酸苜蓿青贮感观评定均能达到优质青贮品质标准;各处理组与贮前比...     

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2～4和4～5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

苜蓿转基因的研究现状和前景

综述了苜蓿转基因研究的现状,介绍了转基因苜蓿研究中的常见问题,展望了转基因苜蓿的应用前景.     

紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测

根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),扩增编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl₂冻融法将其转入农杆菌菌株中,然后采用农杆菌介导的方法,转化紫花苜蓿,共得到11株抗性苗,对其中的4株进行卡那霉素基因PCR检测,均得到了目的条带。同时对这4株抗性苗进行目的基因的RT-PCR检测,均得到了目的条带。说明MsZIP基因已经成功在苜蓿中超表达。为了进一步验证该基因的功能,分别用200 mmol/L NaCl和25 μmol/L PEG-6000处理转基因苜蓿,3 d后进行生理指标的测定。结果表明,MsZIP基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的耐盐性和耐旱性。     

DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究

以黑龙江紫花苜蓿Medicago sativa主栽品种:肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号和公农2号为受体材料,系统地探讨了除菌剂种类和浓度以及卡那霉素筛选浓度等,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系;分别构建了由诱导型启动子rd29A和组成型启动子E12调控的DREB2A基因的2个植物表达载体pB2A29A和pB2AE12;采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得大量转基因抗性植株并进行了分子生物学(PCR和Southern blot)检测.结果表明,DREB2A基因已整合到苜蓿基因组中.     

柱花草和苜蓿抗氧化系统及光合作用的季节性变化

为探讨热带和温带牧草对温度胁迫抗性差异的生理机制,本文比较研究了柱花草(Stylosanthes guianensis)和苜蓿(Medicago sativa)叶片抗氧化系统、可溶性糖和叶绿素荧光参数的季节性变化。结果表明:柱花草在冬季丙二醛(MDA)含量升高,苜蓿MDA含量在夏季升高;柱花草超氧化物歧化酶(SOD)活性在越冬前和越夏前升高,苜蓿SOD活性在秋冬季较高,春夏季较低;柱花草和苜蓿的过氧化氢酶(CAT)活性在越冬前均升高,但柱花草春夏季维持稳定,苜蓿CAT活性夏季升高;柱花草抗坏血酸-过氧化物酶(APX)活性全年较稳定,苜蓿的APX活性在春夏季不断升高;柱花草抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量在越冬前、后均升高,而苜蓿只在越冬前升高,越冬后维持稳定水平;柱花草和苜蓿的可溶性糖含量在越冬前均积累,柱花草积累高峰出现得较晚,且在越冬后再次大量积累,苜蓿在越冬前就大量积累,更有利于提高抗寒性;柱花草光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(F_v/F_m)和非光化学荧光猝灭(NPQ)在冬季有一定程度降低,PSⅡ光化学量子效率(Ф_PSⅡ)和光化学荧光猝灭(q_p)等叶绿素荧光参数明显降低,苜蓿F_v/F_m、Ф_PSⅡ和q_p等参数较稳定,但NPQ在春夏季不断降低。这说明,柱花草和苜蓿抗寒和抗热性的不同与其抗氧化系统、可溶性糖和PSⅡ季节性变化的差异有关。     

Bar基因转化草原1号苜蓿的研究

利用农杆菌介导法将抗草丁膦的Bar基因导入草原1号苜蓿,经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性,通过多聚白酶连式反映检测,初步证实目的基因已转入到苜蓿基因组中.     

转OvBAN/bar双价基因的紫花苜蓿对虫蚀及除草剂的耐受性分析

以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸

乳酸、乙酸、丙酸、丁酸是紫花苜蓿青贮中的主要有机酸。运用高效液相色谱仪,Shodex KC-811色谱柱,3 mM高氯酸为流动相,流速1 mL/min,进样量5μL,柱温50℃,岛津SPD-10A检测器,检测波长210 nm,对紫花苜蓿青贮浸提液的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量同时测定,有机酸分离效果理想,精密度高,回收率好。运用该方法测定数据真实可靠,操作简单。     

转多抗基因新疆大叶苜蓿光合生理特征对土壤水分变化的响应

以新疆大叶苜蓿及其为母本的4种转基因株系(SN:转AtNDPK2基因;SC:转codA基因;SOR:转IbOr基因;SAF:转AtABF3基因)为研究材料,通过盆栽控制试验,比较研究了不同土壤水分条件下始花期各株系苜蓿的光合和荧光参数特征。结果表明,随土壤含水量从80% FC(田间持水量)降至40% FC,各株系叶片净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)和气孔导度(G_s)均呈下降趋势,叶片瞬时水分利用效率(WUE_i)呈上升趋势。在40% FC时,各转基因株系P_n值(11.19~21.58 μmol·m^-2·s^-1)均显著(P<0.05)大于非转基因株系(6.06 μmol·m^-2·s^-1),各株系间WUE_i无差异但以转AtABF3基因株系最大(3.22 μmol·mmol^-1)。土壤水分降低过程中,各株系叶片初始荧光(F_o),最大光化学效率(F_v/F_m)和光化学淬灭系数(qP)值总体呈下降趋势,实际光化学效率(Φ_PSⅡ)和表观电子传递效率(ETR)值呈先上升后下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)值整体呈上升趋势。转基因株系qP值出现显著下降时的土壤水分含量(50% FC)低于非转基因(70% FC)苜蓿。在40% FC时,转基因株系F_v/F_m(0.78~0.82)值显著高于非转基因苜蓿(0.58)。总体表明,转多抗基因均不同程度地提高水分胁迫条件下新疆大叶苜蓿的光合性能,其中转codA基因株系可维持较高光合速率,转IbOr基因株系能维持较高光能利用能力,转AtABF3基因株系能够高效利用水分,转AtNDPK2基因株系总生物量最高。     

磷对铝胁迫紫花苜蓿幼苗根系生长和生理特征的影响

为了探究磷对铝胁迫下紫花苜蓿幼苗生长和生理特征的影响,分别用不含和含200 μmol·L^-1磷（P）、100 μmol·L^-1铝（Al）、200 μmol·L^-1 P+100 μmol·L^-1 Al的简易 ［Ca（NO₃）₂］营养液（pH=4.5）处理铝敏感紫花苜蓿品种‘Wl440’幼苗。结果表明,在铝处理中添加磷后,苜蓿幼苗根系和叶片中的铝含量分别比铝处理降低81.53%和61.47%,苜蓿幼苗的根长和根系活力显著提高,叶片电导率和丙二醛（MDA）含量显著下降;光合生理得到明显改善,与铝处理相比,磷添加处理幼苗叶片的叶绿素含量、蒸腾速率、气孔导度和光合速率明显提高,光系统Ⅱ和光系统I的电子传递速率增加;磷添加处理明显提高了铝胁迫苜蓿根系的草酸和苹果酸含量,体内有机酸螯合铝离子的能力增强,光合能力提高。因此,磷能够通过增加根系有机酸含量,改善铝胁迫苜蓿光合系统,从而缓解苜蓿铝毒害。     

碱胁迫应答基因GsARHP的克隆及转基因紫花苜蓿的耐碱性分析

本研究基于实验室前期野生大豆碱胁迫转录组数据,筛选出一个碱胁迫下上调表达的假定蛋白基因,暂命名为GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)。首先利用Real-time PCR方法验证了GsARHP基因受碱胁迫诱导表达。生物信息学分析表明,该基因编码一个含有130个氨基酸的亲水蛋白,含有信号肽但无跨膜结构域;构建了GsARHP植物超量表达载体,利用农杆菌介导的子叶节侵染法转化肇东紫花苜蓿,通过PCR,Southern Blot和RT-PCR方法检测获得了3个超量表达GsARHP基因的转基因株系,并对其耐碱性进行了分析。结果表明,在0,100和150 mmol/L NaHCO₃处理14 d后,非转基因株系明显萎蔫、黄化甚至死亡,而转基因株系则长势良好;进一步分析其生理指标显示,相对质膜透性与丙二醛含量均显著低于非转基因株系(P<0.01),而叶绿素含量与CAT活性显著高于非转基因株系(P<0.01),说明GsARHP基因的超量表达可以增强紫花苜蓿的耐碱能力。     

Diurnal changes in photosynthesis and photosynthetic product partitioning in alfalfa in response to phosphorus application北大核心CSCD

This research explored the effect of different levels of phosphorus application on diurnal variation in photosynthesis and partitioning of photosynthetic products in alfalfa under drip irrigation. In particular, the relationship between photosynthetic product levels in the plant and leaf photosynthetic parameters of alfalfa was clarified. Four phosphorus（P2O5）application levels of 0（CK）,50（P1）,100（P2）and 150 kg·ha-1（P3）were used as treatments in a field experiment. Leaf photosynthetic parameters were measured with a Li-6400 portable photosynthesis instrument on sunny days from 10：00-20：00 during the early flowering stage,together with environment factors and sugar and starch content in the leaves,stems and roots. A feature of the results was a ‘photosynthetic noon-break’phenomenon across all phosphorus application treatments,and stomatal limitation was the main factor responsible for the mid-day decline of net photosynthetic rate （Pn）. Photosynthetically active radiation had the greatest impact on the Pn of alfalfa leaves,while atmospheric CO2 concentration,atmospheric temperature,and atmospheric environmental factors such as relative humidity and vapor pressure deficit based on leaf temp also affected Pn. Principal component analysis showed that alfalfa photosynthetic efficiency in the four P-treatments ranked P2>P1>P3>CK. At the 100 kg·ha-1 phosphorus level（compared to CK）,the hay yield of alfalfa was increased significantly,the soluble sugar contents of leaves,stems,and roots were increased by 11. 6%,5. 0% and 4. 6%,respectively,and the starch contents were increased by 15. 2%,9. 6% and 5. 3%,respectively. Higher overall levels of soluble sugar and starch typically manifested as greater concentration increases in leaves,and relatively smaller increases in roots and stems. The diurnal troughs in Pn,transpiration rate,leaf internal CO2 concentration and water use efficiency（WUE）of alfalfa leaves were less marked in the P treatments,compared with the control treatment. Therefore,appropriate phosphorus application can increase the photosynthetic efficiency of alfalfa leaves,thereby significantly promoting crop growth and development. At the phosphorus（P2O5）application rate of 100 kg·ha-1（P2）,the alfalfa photosynthetic enhancement effect was the most pronounced. © 2022 Editorial Office of Acta Prataculturae Sinica. All rights reserved.     

外源2,4表油菜素内酯对越夏期高温与弱光胁迫下紫花苜蓿生长和光合性能的影响

为探讨外源2,4表油菜素内酯(EBR)对高温与弱光胁迫下紫花苜蓿生长与光合性能的调节作用,采用绿色遮阳网模拟遮荫条件,设置3种光环境[全光照(L₀)、46.30%透光率(L₁)和28.63%透光率]和4种EBR浓度[蒸馏水(CK)、0.01、0.1和1 mg·L^-1],研究越夏期弱光胁迫下叶面喷施EBR对紫花苜蓿幼苗的形态、生长、光合色素含量、光合参数和光合-光响应曲线的影响。结果表明:越夏期随遮荫程度增加,紫花苜蓿冠层光合有效辐射(PAR)、红光与远红光比值(R/FR)、红光和紫外光波段占PAR的比例明显下降,绿光波段占PAR的比例明显上升;遮荫及EBR处理下,与对照相比,紫花苜蓿叶面积,叶重比,节间长,茎叶夹角,叶绿素a、b含量和胞间CO₂浓度明显增加,叶面温度(T_leaf)和类胡萝卜素含量明显降低。轻度遮荫及1 mg·L^-1 EBR处理下紫花苜蓿净光合速率和最大净光合速率与L₀无显著差异。Pearson相关分析结果表明,越夏期遮荫条件下,紫花苜蓿冠层PAR、R/FR和紫外光波段占PAR的比例与光强显著正相关。遮荫及EBR处理下,紫花苜蓿根重比与光强显著正相关,主茎节数与光强无明显相关性。综合上述结果,越夏期遮荫条件下,外源EBR可调整紫花苜蓿植株结构,降低叶面温度,促进光合色素的合成,提高光合效率,缓解高温与弱光对紫花苜蓿生长的抑制作用。L₁条件下,外源1 mg·L^-1 EBR对紫花苜蓿生长的促进作用最明显。     

抗坏血酸和水杨酸丸衣对NaCl胁迫下紫花苜蓿种子发芽特性的影响

为探究抗坏血酸（AsA）和水杨酸（SA）丸衣对NaCl胁迫下紫花苜蓿种子萌发的缓解效应,以紫花苜蓿种子为试验材料,采用不同浓度的AsA（1、2、4、8 mmol·L^-1）和SA（1、5、10、20 mmol·L^-1）对紫花苜蓿种子拌种后进行丸衣处理（未丸衣种子为CK₁,不做拌种处理的丸衣种子记为CK₂）,分析丸衣种子在NaCl胁迫下发芽特性的变化,以期获得能有效缓解紫花苜蓿种子盐胁迫效应的种子丸衣配方。结果表明,1.25%和1.50%的NaCl胁迫显著（P<0.05）降低了紫花苜蓿未丸衣种子的发芽率、发芽势、种苗长和种苗重,延长了平均发芽时间。AsA在1.25%NaCl胁迫下缓解效果不明显,4 mmol·L^-1AsA拌种后丸衣处理,能提高1.50%NaCl胁迫下紫花苜蓿种子的发芽率、种苗长。1 mmol·L^-1SA拌种后丸衣处理,能提高1.50%NaCl胁迫下紫花苜蓿种子的发芽势、发芽率和种苗长,而20 mmol·L^-1SA拌种后丸衣处理降低了紫花苜蓿种子的发芽率。说明AsA和SA丸衣对NaCl胁迫的缓解作用与其拌种浓度和NaCl胁迫浓度有关。本试验筛选出4 mmol·L^-1AsA和1 mmol·L^-1SA拌种丸衣配方对NaCl胁迫的缓解作用最优,该结果为AsA和SA丸衣应用于紫花苜蓿种子缓解NaCl胁迫提供依据。     

高寒阴湿区6个抗寒紫花苜蓿种质氨基酸积累量分析

为了评价6个抗寒紫花苜蓿种质(GNKH-1、2和3、俄罗斯西伯利亚杂花苜蓿、金皇后紫花苜蓿和阿尔冈金紫花苜蓿)的种质,在青藏高原高寒阴湿区进行了播种当年的评比试验,并对地上部分叶和茎中的氨基酸含量进行分析。结果表明:氨基酸总量(T)在GNKH-2叶最高(23.86%),在俄罗斯西伯利亚杂花茎中最高(12.13%);必需氨基酸(E)在金皇后叶(8.55%)和茎(4.27%)中最高。供试苜蓿叶蛋白种质从高到低排序为:金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>阿尔冈金>俄罗斯西伯利亚杂花;苜蓿茎蛋白品质从高到低排序为:金皇后>GNKH-1>GNKH-2>GNKH-3>俄罗斯西伯利亚杂花>阿尔冈金。综合分析表明,抗寒苜蓿材料中GNKH-1叶和茎蛋白质价值均最高;GNKH-3是抗寒苜蓿材料中氨基酸评分相对最高的,叶部氨基酸评分(AAS)为32.74,茎部为15.94,均高于其他供试苜蓿品系;阿尔冈金和GNKH-1叶部EAAI值最高,分别为1.2860和1.2847;GNKH-2(1.2872)仅次于俄罗斯西伯利亚杂花和阿尔冈金茎部的EAAI值(1.2881,1.2876)。