棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析

 以棉花强致病力黄萎病菌株V592为材料,利用农杆菌介导的T-DNA插入技术构建了一个含15000个转化子的突变体库,对突变体的生物学特性、致病力及T-DNA插入拷贝数进行研究,结果显示：(1) 突变体的菌落形态分为菌核型、中间型、菌丝型和菌膜型,分别占92.12%,4.54%,3.19%和0.15%;（2）菌核型、中间型和菌丝型菌株,在菌落生长速度和孢子大小方面无明显差异;而在产孢量方面,菌核型普遍强于中间型和菌丝型;（3）致病性测定显示,菌核型的致病力普遍强于中间型和菌丝型;（4）Southern杂交显示,T-DNA单拷贝数插入的突变体比率约为70.99%,而菌核型的单插入率为80.00%,明显高于中间型(69.23%)和菌丝型(64.71%)。以上结果表明,农杆菌介导转化技术可用于棉花黄萎病菌突变体库的快速构建,突变体的菌落表型与其产孢能力、致病力及T-DNA插入拷贝数等之间存在一定的相关性。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

棉花黄萎病菌插入突变体库的构建及致病相关基因DVK1的克隆与鉴定

 利用ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）技术自建Verticillium dahliae强致病力落叶型菌株T-DNA插入突变体库,共获得5000个转化子;随机挑选1000个转化子进行致病力鉴定,筛选获得5株致病力衰退的突变体。挑选致病力下降最为明显的突变体d1,通过TAIL-PCR技术最终获得一段长3237 bp的DVK1全长cDNA序列,编码1079个氨基酸的蛋白。基于DNA序列比对发现,DVK1基因含有2个内含子,分别为52 bp和36 bp。进一步比对发现T-DNA插入到DVK1基因启始密码上游740 bp的启动子中。通过遗传互补实验d1 恢复了致病性,进一步证明DVK1基因与黄萎菌致病性相关。     

河北省棉花黄萎病菌致病性的研究

在棉花苗期采用塑料营养钵底部定量注菌液法接种，于昼温２５～２６℃，夜温２０～２２℃的人工培养室中测定了自河北省重点植棉县分离的４０个棉花黄萎病菌单孢菌系和外地５个菌系的致病性。以中棉石系亚、海岛棉海７１２４、陆地棉９３抗１２、辽棉５号、冀棉１１号、农大３６５６个品种为鉴别寄主，以病情指数作为划分抗、感类型的标准，根据在鉴别寄主上的反应，４５个供试菌系可被划分为致病力强的Ⅰ型、致病力中等的Ⅱ型和致病力弱的Ⅲ型，分别占５３．５％、２８．９％、１７．８％。Ⅰ型菌系除使中棉表现抗（耐）病外，海岛棉和陆地棉均表现感病。该类菌系遍布冀中南棉区，其中有７个菌系可使部分品种表现落叶，证明河北省已有落叶型菌系存在。试验还表明，海７１２４、９３抗１２、冀棉１１号和农大３６５４个棉花品种对黄萎病鉴别力较强，可作为鉴别寄主加以应用     

河南省不同地区棉花黄萎病菌分离物致病性及其毒素致萎活性测定

在河南省不同地区分离并鉴定33株棉花黄萎病菌分离物,并进行了致病力和粗毒素致萎活性测定。致病力结果表明,河南省棉花黄萎病菌分离物可分为强、中、弱3种致病力类型,分别占48.5%、21.2%、30.3%。河南省同一地区内不同分离物间致病力差异明显。粗毒素致萎活性测定结果表明,黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强,弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱,强、中、弱3种致病力类型分离物在72h时对棉苗的平均致萎指数分别为63.82、52.38、45.83。采用考马斯亮蓝法测定不同分离物粗蛋白含量,结果表明,不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异,且与其所致的病情指数呈显著正相关。     

Pathogenicity Differentiation and Pathotype Distribution of Verticillium dahliae from Cotton in Hunan Province

[Objective] The study of pathogenicity differentiation of Verticillium dahliae in the cotton growing areas in Hunan province could provide theories for breeding and promoting resistant varieties as well as integrated control of Verticillium wilt of cotton. [Method] Seventy seven strains of V. dahliae from major cotton growing areas in Hunan province were evaluated their cultural characteristics. The growth rate, sporulation quantity and pathogenicity of 31 strains among them were tested and SAS 9.1.3 statistical analysis software was used to cluster the pathogenicity of the tested strains. The special primer (D-1/D-2 and ND-1/ND-2) for polymerase chain reaction assay was used to test pathotype of 24 strains. [Result] According to their colony morphology on potato dextrose agar media and culture characteristics, the strains were classified into the sclerotium type, the hyphal type and the intermediate type accounted for 14.28%, 42.86% and 42.86%, respectively. The growth rate and sporulation quantity of the strains were 1.22–2.54 mm·d^－1 and 5.3×106–40.6×106 spore·mL^－1, which showed significant difference. In addition, based on the clustering results of average disease index,the strains were clustered into three groups which showed high (Type Ⅰ), low (Type Ⅱ) and moderate (Type Ⅲ) virulence to cotton with the proportion of 3.2%, 12.9% and 83.9%, respectively. [Conclusion] It is conclude that the main culture types of V. dahliae in Hunan province are the hyphal type and the intermediate type, and the strains showed pathogenicity differentiation. The result showed that defoliating pathotype of V. dahliae was dominant in the cotton growing areas of Hunan province．     

棉花黄萎病菌致病类型研究

以研究手段为主线,从形态学特征、凝胶电泳、血清学反应、营养体亲和性及几项分子生物学技术等方面讨论了目前国内外在划分棉花黄萎病菌种内致病类型上的研究进展状况,并在本文基础上作了总结。     

棉花黄萎病菌致病的分子机理

阐述了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)产生的细胞壁降解酶、蛋白酶和毒素在致病中的作用及微菌核形成机制,全面分析了基因组学途径、RNA干涉和农杆菌介导的转化等真菌功能基因组学技术在大丽轮枝菌致病分子机理研究上的进展.     

黄萎病菌侵染对感病棉花品种叶片蛋白质组的影响

为进一步探索黄萎病菌与棉花的相互作用,以感黄萎病棉花品种冀棉11为实验材料,在接种大丽轮枝菌V991 3 d后提取叶片蛋白,运用双向电泳和质谱分析技术研究黄萎病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化。分析发现,与对照相比差异表达量在2倍以上的蛋白点有22个,其中上调表达的蛋白点10个,下调表达的蛋白点12个。质谱鉴定发现,上调表达的蛋白包括ATP合成酶β亚基,Ru Bis CO活化酶1,Ru Bis CO活化酶α2以及果糖-1,6-二磷酸醛缩酶,下调表达的蛋白包括质体叶绿素AB结合蛋白,核酮糖二磷酸羧化酶大链以及核酮糖二磷酸羧化酶小链。分别对下调表达的蛋白rubisco小亚基基因(RBCS)和叶绿素AB结合蛋白基因(cab)、上调表达的蛋白Ru Bis CO活化酶1基因(RCA1)进行荧光定量PCR,发现接种黄萎病菌后3个基因在m RNA水平与蛋白水平上的变化是一致的。通过分析推测,黄萎病菌通过与参与光合能量代谢的蛋白相互作用,破坏植物的光合作用,近而引起棉花叶片的萎蔫与凋零。     

大丽轮枝菌致萎毒力指示菌的筛选及拮抗作用初探

为了筛选可指示Verticillium dahliae致萎毒素毒力大小的指示菌,并对致萎毒素抑制指示菌生长的机理进行初步探讨,采用指示菌平板打孔法,对黑曲霉(Aspergillus niger)BF-3758、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等12种具有微生物种属代表性的菌株进行筛选;采用拮抗试验、致萎试验结合显微观察的方法,初步探索了Verticillium dahliae致萎毒素对指示菌生长的抑制作用。结果表明,Verticillium dahliae粗毒素对Aspergillus niger BF-3758的生长具有较强的抑制作用,且该抑制作用和粗毒素对离体叶片的致萎作用具有一致性,并存在一定的量效关系,Aspergillusniger BF-3758菌株可以作为Verticillium dahliae致萎毒素的毒力指示菌;Verticillium dahliae粗毒素可抑制Aspergillus niger BF-3758的孢子萌发和菌丝生长,对成熟菌丝也有破坏作用。上述研究可为评价Verticillium dahliae的致病力提供一种操作简便、耗时短、费用低的生物学方法。     

新疆南部棉区黄萎病菌种群致病性分化及变异

 采用鉴别寄主法和特异性引物PCR检测技术对采自新疆南部（南疆）棉区的36个棉花黄萎病菌菌系进行检测,以期明确其病原种群致病性分化及变异情况。鉴别寄主法测定结果显示：供试菌系中致病性强、中、弱的菌系分别为27个、4个和5个,各占75.0%,11.1%和13.9%。特异性引物（ND1/ND2和D1/D2）PCR检测结果显示,供试36个菌系中落叶型菌系12个,占33.3%;非落叶型菌系24个,占66.7%。经统计,落叶型菌系的致病力明显高于非落叶型菌系,其平均病指分别为43.8和31.8。接种试验证明,无论落叶型菌系和非落叶型菌系,接种后都可产生落叶症状,但落叶的情况有明显差别,落叶症状的轻重不仅与菌系的致病类型有关,还与棉花品种的抗病性密切相关。     

新疆棉花黄萎病菌致病性分化的研究

对新疆主要植棉区的30个棉花黄萎病菌菌株及陕西省农科院植保所赠送的4个标准菌株进行致病性分化和营养亲和性研究。结果表明,新疆棉花黄萎病菌致病性分化明显,可分为强、中、弱3种类型,34个菌株中的32个菌株可分为2个亲合群,另外两个菌株暂未划定亲合群。     

棉花黄萎菌落叶型菌系毒素纯化及抗血清制备

用SephacrylS 200HR层析柱纯化了V991菌系毒素,经叶片针刺涂抹方法确认其致萎功能后,免疫大白兔制备了抗血清。用间接ELISA方法对强、中、弱3种不同致病力共10个菌株的培养液进行了特异性检测,结果表明:抗血清具备一定生理型特异性,能够准确检出全部强致病力落叶型菌系,可作为不同生理型划分的指标之一。用毛细管电泳、SDS PAGE和Western杂交方法检测了V991毒素的组分:在中性条件下,毒素在毛细管电泳时存在2个峰;SDS PAGE将毒素分为8条带,其中4条主带具有强烈的致萎性;Western点杂交的反应强度与相应蛋白回收带的致萎功能之间明显相关。     

河北省棉花黄萎病菌致病性与ISSR遗传分化

 从河北省17个主要植棉县采集棉花黄萎病株,分离获得52个黄萎病菌单孢菌系,对其培养特性、致病性和ISSR(Inter-simple sequence repeat)遗传分化进行了研究。菌系培养性状研究表明,在采集的52个菌系中,菌核型菌系最多,其次是菌丝型,最少的是中间型,3种类型菌系分别占总菌系的51.9%,38.5%和9.6%。利用7个抗、感不同的鉴别寄主在光、温、湿可控的生长室鉴定了病菌的致病性,供试菌系可分为致病力强、中、弱3种类型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型),分别占供试菌系的51.9%,21.2%和26.9%。在供试菌系中存在比落叶型菌系致病力还要强的非落叶型菌系。基于病情指数的聚类分析结果表明,河北省棉花黄萎病菌系存在明显致病力分化,但与地理来源无关。菌核型菌系和中间型菌系多表现为强致病力或中等致病力,而菌丝型菌系的致病力变化较大。在136个ISSR标记中,80个属于多态性标记,多态性位点百分率达58.8%。基于ISSR的聚类分析结果表明,河北省棉花黄萎病菌的遗传分化较小,并且遗传分化与地理来源相关。     

哈茨木霉厚垣孢子产生突变体的筛选及T-DNA标签序列的克隆

利用PD液体培养基从哈茨木霉T-DNA插入突变体库中筛选出在产孢性状上与野生型菌株明显不同突变子7株,其突变表型主要表现在分生孢子产生数量显著减少和菌丝上有大量厚垣孢子分化.利用TAIL-PCR方法对7株突变体的侧翼序列进行克隆,从5个突变体中获取了5条T-DNA侧翼序列.为木霉菌厚垣孢子产生相关全长基因的克隆和产孢机制的研究奠定了基础.     

新疆棉花黄萎菌不同致病类型的RAPD指纹分析

用 RAPD- PCR技术 ,对采自新疆各地的 2 7个棉花黄萎菌株的遗传分化及致病性进行了研究。从 1 2 0个随机引物中筛选出 1 1个随机引物 ,共在 2 0 4个位点上扩增出 RAPD谱带 ,其中 1 88个为多态性位点 ,占 92 .1 6%。RAPD电泳条带差异表明 ,新疆棉花黄萎病菌种群内部存在着显著的遗传分化。对 RAPD谱带进行聚类分析 ,将 2 7个菌株划分成 3大类群 ,这 3大类群与根据鉴别寄主反应划分的不同致病类型有一定的相关性 ,RAPD谱带差异与菌株的地理分布也有一定的联系     

湖北省棉花黄萎病病菌致病力分化研究

 采用无土育苗和裸苗接种后移栽的方法,对2007－2008年间采自湖北不同地区的32个棉花黄萎病菌菌株和4个对照菌株进行了致病力鉴定。结果表明,强致病力菌株有12个,占鉴定菌株总数的33.3%,中等致病力菌株有19个,占52.8%;弱致病力菌株有5个,占13.9%。该结果表明,湖北存在强致病力的黄萎病菌,而且强致病力菌在该省的三大植棉区均有分布。对不同鉴别寄主对各菌株的反应分析显示,采用无土育苗和裸苗接种相结合的鉴定方法是一项不错的鉴定方法。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

我国棉花黄萎病菌基于SSR的遗传多样性分析

为了对棉花黄萎病菌群体的遗传多样性进行研究,以棉花黄萎病菌基因组DNA为模板,用双因素和单因素水平优化的方法对SSR反应体系的重要参数进行摸索和优化,建立了最适反应体系.从300对引物中筛选出13对多态性较高的引物,并对来自我国12个省96个县(市)的170个棉花黄萎病菌株进行SSR分析.SSR图谱的聚类分析结果将供试...