兔病毒性出血症病毒西藏分离株毒力的测定

对一株兔病毒性出血症病毒(RHDV)西藏株进行血凝性、特异性、致病性及毒力鉴定。结果表明:此株RHDV血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;RHDV的最小致死量为10-5/mL。说明此分离株是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。     

兔出血症病毒ZB株的分离与鉴定

为确定发病兔场兔的死亡病因并对其病原进行鉴定分析,经临床诊断、病理剖检、病毒分离、纯净性检测、血凝性检测、致病性试验、特异性试验、免疫原性试验以及qPCR和测序鉴定,用病死兔病料组织接种健康易感家兔,成功分离到1株兔出血症病毒。分离株病毒不含细菌、霉菌、支原体;对人"O"型红细泡的血凝效价为1∶1024;分离株病毒能够使健康易感兔在96h内全部死亡兔病毒性出血症;兔出血症病毒阳性血清对分离株病毒具有中和作用;用分离株病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性;分离株病毒通过qPCR测序鉴定为RHDV毒株。     

一株幼兔出血症病毒的分离鉴定

从临床兔病料中分离鉴定出1株兔出血症病毒,HA试验测得该毒株血凝价为1：640,琼脂扩散试验可见分离株与RHDV高免血清形成清晰的沉淀线,电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。     

兔病毒性出血症病毒“LQ”株的分离鉴定

对成都龙泉某兔场疑似兔病毒性出血症(RHD)发病兔的病料进行细菌学检查以及血凝性、特异性鉴定,并进一步进行致病性鉴定。结果表明:RHDV LQ株对人"O"型红细胞具有高度血凝性,血凝效价达10×212;RHDV抗血清可特异性抑制RHDV LQ株对人"O"型红细胞的凝集;RHDV LQ株对家兔的LD50为10-6.87/mL,是一株对家兔具有高致病力的强毒株。     

兔病毒性出血症病毒分离鉴定

兔病毒性出血症是由兔病毒性出血症病毒（RHDV）引起的急性、败血性、高度接触性传染病。感染病兔多在48-72小时内死亡,给养兔业造成的威胁日益突出。因此,及时准确地对RHDV进行诊断已经成为防治该病的关键。     

兔出血症病毒ZB分离株VP60基因克隆、截短表达与活性鉴定

为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性.     

兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析

采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV）,扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93．7％－99．2％,氨基酸同源性在97．3％－99．5％,在VP606个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。     

兔病毒性出血症病毒的提纯及部分特性鉴定

应用建立的SDS—蔗糖密度梯度超速离心法,纯化了从兔肝组织中粗提的兔病毒性出血症病毒。通过血凝、电镜观察、SDS-PAGE、琼脂双向免疫扩散、免疫印迹等试验,证明SDS—蔗糖梯度柱分离的病毒纯度高,具有4种结构多肽。     

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。     

Egg yolk IgY against RHDV capsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection

VP60 capsid protein is the major structural and immunogenicity protein of RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV), and has been implicated as a main protein antigen in RHDV diagnosis and vaccine design. In this report, egg yolk antibody (IgY) against N-terminal of VP60 was evaluated and developed as a new strategy for RHDV therapy. Briefly, N-terminal of VP60 (～250aa) fragment was cloned and inserted into pET28a expression vector, and then the resultant plasmid, pET28a/VP60-N, was transformed into E. coli BL21(DE3) for recombinant VP60-N protein (rVP60-N) expression. Next, the rVP60-N was purified by Ni⁺-affinity purification chromatography and identified by Western blotting with RHDV antiserum. After immunizing the chickens with rVP60-N, the anti-rVP60-N IgY was isolated, and the activity and specificity of the IgY antibody were analyzed by ELISA and Western blotting. In our results, the rVP60-N could be expressed in E. coli as soluble fraction, and the isolated anti-rVP60-N IgY demonstrated a high specificity and titer (1:22,000) against rVP60-N antigen. For further evaluation of the IgY efficacy in vivo, rabbits were grouped randomly and challenged with RHDV, and the results showed that anti-rVP60-N IgY could significantly protect rabbits from virus infection and promote the host survival after a sustained treatment with anti-rVP60-N IgY for 5 days. Taken together, our study demonstrates evidence that production of IgY against VP60 could be as a novel strategy for the RHDV therapy.     

兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析

根据GenBank已发表的多株RHDV全基因组序列，设计3对扩增RHDVCD株的特异性引物，扩增了RHDV CD株包含全序列的3个片段，并分别克隆到pMD18-T载体上。根据引物上唯一的交叉酶切位点，把三个克隆片段同时克隆到pUC18载体上，获得了RHDV CD株全基因组克隆，测定了全基因组序列（GenBank accession number AY523410）。进行了CD株全序列与GenBank上已发布的其他6株全序列比较及基因进化树分析。发现除CD株外，其余6株（西班牙AST-89株、法国SD株、意大利BS89株、德国分离1株、德国分离2株、澳大利亚Czech V351株）之间的同源性均很高，在93．9％～100％之间，而CD株与其他6株之间的同源性均较低，在89．0％～89．6％之间。德国的2个分离株序列完全相同，应为同一毒株：进化树分析表明，此7株病毒可形成2个明显的分支，中国CD株形成一个分支，其余欧洲、澳大利亚分离株开成一个分支，具有明显地域差异特征．     

兔出血症病毒西藏野毒分离株的鉴定

对西藏农牧学院分离的一株兔出血症病毒(RHDV)西藏野毒进行血凝性、特异性和致病性进行鉴定。结果表明,此株RHDV野毒血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;西藏株RHDV的最小致死量为10^-5／mL,是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus,ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞（LT）,并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID₅₀测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）;大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1 137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%~100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID₅₀值为10^-5.68/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。     

RHDV在多种属动物体内分布及细胞免疫水平

应用纯化兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV),接种小鼠、豚鼠、SPF鸡、仔猪4d后剖杀,分离组织,通过电镜观察、血凝试验(HA)、RT-PCR,进行体内分布检测;同时将上述动物进行3次免疫,三免后10d分离外周血淋巴细胞进行IFN-γ、IL-4、WST检测病毒刺激指数(SI)。结果显示,通过电镜观察未见到病毒粒子;HA检测结果为肝脏的HA价最高,而肺脏最低;RT-PCR未检测到目的基因;WST检测结果免疫组刺激指数高于对照组;免疫组的IFN-γ和IL-4检测数高对照组。结果表明,RHDV在多种属动物分布规律相同,均能产生细胞免疫反应,为下一步试验奠定基础。     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.