虫草素预防肥胖及通过ADORA_1介导GH3细胞中泌乳素分泌研究

为了研究虫草素是否具有预防肥胖的作用及其可能机制,试验利用高脂饮食诱导肥胖型高脂血症大鼠动物模型,并给予高、中、低不同剂量(50、25、12.5mg/(kg·d))的虫草素,连续灌胃35d后观察大鼠体重、脂肪系数、血脂水平的变化;体外培养大鼠脑垂体瘤细胞(GH3),通过CCK8、Western blotting、ELISA等方法检测虫草素对GH3细胞的增殖毒性,以及腺苷受体A1(ADORA_1)的表达和对泌乳素分泌量的影响。体内试验结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠体重、脂肪系数和血脂水平(高密度脂蛋白(HDL)除外)均极显著升高(P0.01);虫草素高、中、低各剂量组均能极显著或显著降低大鼠体重、脂肪系数及总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平(P0.01;P0.05),但HDL水平仅在虫草素高剂量组中显著升高(P0.05),而虫草素中、低剂量组均无显著变化(P0.05);体外试验结果显示,虫草素浓度低于25μg/mL时对GH3细胞增殖无影响;虫草素能够诱导GH3细胞ADORA_1表达升高;虫草素和ADORA_1激动剂(R-PIA)单独作用能显著或极显著降低泌乳素的分泌量(P0.05;P0.01),虫草素与ADORA_1抑制剂(DPCPX)联合作用时能够在一定程度上阻断虫草素对泌乳素的抑制作用。结果表明,虫草素具有预防肥胖和降血脂的作用,其可能的作用机制是通过诱导ADORA_1表达抑制泌乳素的分泌,该研究结果将为虫草素作为一种潜在的减肥降脂药物的开发提供一定依据。     

蚕蛹虫草中虫草素的提取及纯化工艺研究

本实验主要对蚕蛹虫草中虫草素(3’—脱氧腺嘌呤核苷、学名3’—Deoxyadenosine)进行纯化及纯度鉴定。结果表明:经过对蚕蛹虫草子实体及菌丝的粉碎、石油醚脱脂、80℃水浴10小时、调节等电点沉淀、732-NH_4离子交换树脂的分离、浓缩、5℃下低温结晶,可得到一定纯度的虫草素晶体。     

蛹虫草中虫草素、腺苷综合提取工艺研究

以蛹虫草为材料,采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法4种提取方法,选择虫草素和腺苷的最优提取方法,并用正交试验方法考察超声波水提法中提取温度、提取次数、提取时间、料液比4个因素对虫草素、腺苷综合提取效率的影响,确定虫草素、腺苷综合提取最佳工艺。结果表明,超声波水提法是综合提取虫草素和腺苷的最优方法,其最佳工艺条件为:用10倍量的水于60℃超声波提取2次,每次40min。     

蛹虫草培养残基中虫草素的水热回流提取及含量测定

【目的】 探究水热回流法提取蛹虫草培养残基中活性成分虫草素的最佳工艺参数。【方法】 选取液料比、提取次数、提取温度、提取时间4个因素进行单因素试验和正交试验,并通过高效液相色谱法（HPLC）测定虫草素含量,确定水热回流法提取蛹虫草培养残基的最佳工艺参数。【结果】 方法学验证结果表明,蛹虫草培养残基中虫草素含量的HPLC测定方法精密度、重复性、稳定性相对标准偏差（RSD）均<2%,准确度RSD为2.64%,标准曲线线性相关性高。正交试验结果显示,影响水热回流法提取效果的因素依次为提取时间、提取次数、液料比、提取温度,其中提取时间和提取次数对提取物虫草素含量均有显著影响（P<0.05）,提取温度和液料比影响不明显（P>0.05）。单因素试验和正交试验结果表明,蛹虫草培养残基的最佳提取工艺参数为：液料比25：1、提取次数5次、提取温度70 ℃、提取时间60 min,该提取条件下测得蛹虫草培养残基中虫草素含量为1.48 mg/g。【结论】 采用本研究确定的水热回流法最佳工艺参数能有效提取蛹虫草培养基活性成分,且操作简单实用,提取物活性成分得率稳定,为后续蛹虫草培养残基产品开发提供参考依据。     

银杏叶提取物通过脂联素/脂联素受体1/腺苷酸激活蛋白激酶信号通路改善肥胖犬脂质代谢及脂肪沉积的研究

本试验旨在研究脂联素（APN）/脂联素受体1 (AdipoR1)/腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信号通路在银杏叶提取物改善高脂饮食诱导的肥胖犬脂质代谢及脂肪沉积中的作用。试验选取雄性成年泰迪型贵宾犬50只,适应性饲喂2周后分成对照组（A组,n=6）和高脂饲粮组（n=44）。对照组饲喂基础饲粮,高脂饲粮组饲喂高脂饲粮（基础饲粮+25%猪油）。饲喂8周后高脂饲粮组成功建立肥胖犬模型,筛选30只肥胖犬,等分成5组：高脂饲粮对照组（B组,n=6）、银杏叶提取物组（C组,n=6）、阴性siRNA(N-siRNA)对照组（D组,n=6）、APN-siRNA组（E组,n=6）和AdipoR1-siRNA组（F组,n=6）。A组继续饲喂基础饲粮,其他各组继续饲喂高脂饲粮。C组、D组、E组和F组每天按50 mg/kg BW的剂量灌服银杏叶提取物,A组和B组灌服等量生理盐水。此外,D组、E组和F组在腹部皮下注射500μL siRNA,A组、B组和C组注射等体积生理盐水,每周3次。试验周期为4周。试验结束后,测量试验犬的体重及体脂率,测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C...     

黄芩苷黄芩素小檗碱对LLC-PK1细胞炎症模型中TNF-α IL-1β及IL-6表达的影响

研究中药黄芩苷、黄芩素、小檗碱对细菌脂多糖(LPS)诱导的猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)中肿瘤坏死因子-α(TNG-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)表达的影响。用噻唑蓝比色法(MTT法)筛选LPS、黄芩苷、黄芩素和小檗碱对细胞作用的最佳浓度,用RT-PCR检测TNF-α、IL-1βmRNA表达,以确定细胞炎症模型是否建立成功;炎症模型建立后,用最佳浓度的黄芩苷、黄芩素和小檗碱分别作用细胞24h,用qPCR检测TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA的表达量。结果LPS刺激组细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达量极显著高于正常对照组(P0.01),黄芩苷、黄芩素和小檗碱作用组细胞TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA表达量比LPS刺激组显著降低(P0.05),与对照组无显著差异(P0.05)。上述结果表明,黄芩苷、黄芩素和小檗碱通过抑制炎症细胞TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表达,从而发挥抗炎作用。     

秦公散对小鼠血清中E选择素和细胞间黏附分子1含量的影响

黏附分子在炎症局部血液循环障碍中扮演着重要角色,白细胞的贴壁、边流主要由E选择素(Esekctin)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)介导.秦公散是通过正交试验筛选得到的用于治疗奶牛乳房炎的复方中药制剂,研究其对小鼠血清中E-selectin和ICAM-1含量的影响,对阐明其活血化淤作用具有重要意义.     

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。     

茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

通过检测茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度变化,探索茯苓主要成分茯苓酸对仔猪水肿病的疗效机制.将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱ e组、不同质量浓度茯苓酸处理组5个组,采用ELISA法测定了培养3,6,9,12 h细胞上清液中P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化.结果表明,不同质量浓度茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞过量分泌P-选凝素、TNF-α无明显的抑制作用;0 mg/L茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的分泌具有明显的下调作用,使其分泌sICAM-1的浓度逐渐下降至正常水平.由此可见,茯苓酸通过抑制SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的过量分泌,阻止白细胞与内皮细胞之间的牢固黏附,防止过度炎症反应对机体的损害,以达到治疗疾病的目的.茯苓酸保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量为10 mg/L.     

miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素（GH）分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics（miR-93-mi组）、mimics对照品（NC对照组）、inhibitor（miR-93-in组）、inhibitor对照品（iNC组）转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体（GHRHR）的3'UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）;miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）,而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组（P<0.05）。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

Effect of Prolactin Isolated from Human Amniotic Fluid on Cultured Bovine Cells of the Reproductive Tract and Splenocytes

Contents: Prolactin (PRL) was isolated from human amniotic fluid and than fractionated on Concanavalin A-Sepharose (ConA-S). Two fractions were tested for the ³H-thymidine incorporation in the DNA of bovine granulosa, oviductal and stromal cells as well as splenocytes. All cell types reacted to PRL I or PRL II in a dose dependent manner. In general the effect of PRL I was greater than PRL II, and low concentrations of both enhanced the cell proliferation more than higher doses. The incorporating effect of ³H-thymidine under the influence of PRL I was higher in stromal cells and splenocytes than in granulosa and oviductal cells. PRL II did not have such a stimulating effect, even the presence of 14 ng/ml resulted in a decrease of ³H-thymidine incorporation in granulosa cells. The reason of this different intensity of tested PRL variants may depend on the molecular heterogeneity. The results indicate that PRL forms possess a cel type-specific effect on the proliferation of cells of the bovine female reproductive tract and splenocytes.     

葛根素对Akt通路调控3T3-L1脂肪细胞分化的影响

为了研究葛根素（puerarin）对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响,探索其在成脂分化过程中的潜在作用机制,试验在脂肪形成过程中将0、10、50 μmol/L葛根素加入到诱导分化培养基中诱导分化,分别通过油红O染色法及甘油三酯酶法检测葛根素对3T3-L1脂肪细胞的脂滴积累、甘油三酯的影响;采用实时荧光定量PCR检测脂肪细胞中CCAAT-增强子结合蛋白α（C/EBPα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的mRNA表达量,Western blotting检测脂肪形成相关转录因子及Akt信号通路的蛋白水平的表达量。结果表明,10 μmol/L葛根素极显著增加了成熟脂肪细胞中脂滴和甘油三酯（TG）的积聚,极显著促进了脂肪形成相关转录因子C/EBPα和PPARγ的mRNA和蛋白水平的表达量（P<0.01）。进一步研究发现,与对照组相比,葛根素的刺激可增强Akt信号通路Ser473蛋白的磷酸化表达水平,表明葛根素对成脂分化过程的促进作用很大程度上是通过Akt信号通路的磷酸化来实现的。综上所述,葛根素能够促进3T3-L1前体脂肪细胞的分化,改善胰岛素敏感性,其作用机制与激活Akt信号通路Ser473位点的磷酸化水平有关。本试验结果可为研究胰岛素的效应机制提供新见解,为胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新思路。     

催乳素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在探讨催乳素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛BMECs为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加不同浓度催乳素[0(对照)、100、300、500和1 000 ng/m L],继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:1)催乳素浓度为100、300 ng/m L时,BMECs相对增殖率显著高于对照组与其他试验组(P0.05)。2)与对照组相比,300 ng/m L催乳素能够显著提高BM ECs乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、二酰甘油酰基转移酶(DG AT)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达量及甘油三酯的含量(P0.05),硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达量有增加的趋势。3)与对照组相比,100、300 ng/m L催乳素能够显著提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、催乳素受体(PRLR)基因表达量(P0.05);300 ng/m L催乳素能显著提高αS1酪蛋白(CSN1 S1)基因表达量(P0.05)。综上所述,100~300 ng/m L的催乳素对BM ECs乳脂和乳蛋白合成有较好的促进效果。     

STAT3基因对广西黄牛肌肉干细胞成肌诱导分化的调控研究

研究旨在检测信号转导与转录激活因子3（STAT3）的表达规律,克隆STAT3基因,构建真核表达载体,并探索STAT3基因对广西黄牛肌肉干细胞（MuSCs）分化的调控作用。采集6、12、18月龄广西黄牛肌肉组织以及生长期（GM）和分化期（DM）肌肉干细胞,分别提取RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测STAT3基因和成肌相关基因的表达规律;克隆黄牛STAT3基因完整编码区序列,构建过表达载体pCD-STAT3并检测其对黄牛肌肉干细胞分化的影响。实时荧光定量PCR结果表明,STAT3基因在6、12、18月龄黄牛肌肉组织中均有表达,且在18月龄中表达量最高,12月龄中表达量最低;STAT3和成肌调节因子6（MYF6）基因在分化期肌肉干细胞中表达量均极显著高于生长期（P<0.01）。广西黄牛STAT3基因编码区全长2 313 bp,与空载体pCDNA3.1相连成功构建过表达载体pCD-STAT3,将pCD-STAT3转入体外培养广西黄牛肌肉干细胞,肌肉干细胞中STAT3基因及成肌决定蛋白（MyoD1）、骨骼肌肌球蛋白重链（MyHC）基因表达量极显著升高（P<0.01）,肌细胞生成素（MyoG）基因表达量显著升高（P<0.05）,且肌管数量、大小均显著高于pCDNA3.1组（P<0.05）。本研究检测了转录因子STAT3在广西黄牛背最长肌中的表达规律;且过表达STAT3基因显著促进了广西黄牛肌肉干细胞的成肌分化,为深入研究STAT3基因在肌肉生长发育中的作用及其分子调控机制奠定基础。     

妊娠后期限饲对母羊分娩后血中GH、IGF-I、T3、T4和INS浓度的影响

选择经同期发情且同期受孕,妊娠90 d的健康蒙古绵羊100只,分为代谢能(ME)0.175 MJ/(kgw0.75.d)(RG1)0、.33 MJ/(kgw0.75.d)(RG2)以及自由采食对照组(CG)3个营养水平处理组,研究妊娠后期不同营养水平限制饲养对母羊分娩后生理补偿期内血中GH、IGF-I、T3、T4和INS浓度的影响。结果表明:母羊从分娩后10 d开始,各限制组RG1和RG2组GH浓度均处于较高水平,而IGF-I、INS、T3、T4浓度仍处于较低水平,与对照组相比差异不显著;分娩30 d后,各组各指标变化复杂,RG1和RG2组GH浓度均有所下降,而IGF-I、INS、T3、T4浓度缓慢回升,到150 d后,各限制组GHI、GF-II、NS、T3、T4浓度都与对照组水平持平,而且在整个生理补偿期内,RG2组表现更突出。     

鼠李糖乳杆菌对Caco-2细胞抗氧化功能和细胞因子分泌的影响

本研究旨在探明鼠李糖乳杆菌(L rhamnosus)对Caco-2细胞抗氧化和非特异免疫功能的影响.Caco-2 细胞分别用PBS(A组)、E.coli K88(B组)和L.rhamnosus(C组)处理,以及先用L.rhamnosus预处理,再用E.coli K88处理(D组).结果表明,B组细胞上清的T-AOC浓度显著降低(P＜0.01),SOD活力显著提高(P＜0.01),C组与此相反,并且细胞裂解液中的SOD活性显著提高(P＜0.05).B组和C组不同程度地促进APRIL的分泌(P＜0.01),而抑制IL-8的产生(P＜0.01).B组也抑制IL-10的产生,但C组却显著促进其分泌(P＜0.01).与B组相比,D组APRIL显著减少(P＜0.01),但IL-8和IL-10都显著增加(P＜0.05,P＜0.01).结果提示,L.rhamnosus可提高Caco-2细胞的抗氧化能力,减轻炎症反应,具有保护作用和免疫佐剂的效果.     

半胱胺对藏绵羊断奶羔羊血清GH、SS、IGF-1水平的影响

试验研究了半胱胺(CS)对藏绵羊断奶羔羊血清中生长激素(GH)、生长抑素(SS)、血清中胰岛素样生长因子(IGF-1)的影响。将40只80日龄左右且始重平均为16 kg的(公母各半)藏绵羊断奶羔羊随机分为2组,在日粮精料中添加300 mg/(kg·BW)的CS,隔日添加1次,试验期42 d。分别于开始用药后的第0、7、14、21、28、35天早晨空腹颈静脉采血样,以放射免疫法测定血浆中GH、SS、IGF-1。结果表明,试验组精料中添加CS使藏绵羊断奶羔羊血清GH、IGF-1都有不同程度的提高,且试验组与对照组相比都有显著差异(P0.05);SS均有不同程度的下降,试验组与对照组相比第3周开始有显著差异(P0.05)。     

miR-142-3p对人乳腺上皮细胞MCF-10A增殖及乳蛋白合成的影响

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为22 nt的非编码的调控性小RNA,在诸多生命活动中发挥重要作用,如参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生发展。本试验应用脂质体转染技术抑制miR-142-3p在人乳腺上皮细胞的表达。试验采用实时荧光定量PCR、Western blotting、细胞增殖分析等技术,探索miR-142-3p对人乳腺上皮细胞增殖及乳蛋白合成的影响。结果显示,miR-142-3p沉默后,催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)蛋白表达增强,同时,相关通路蛋白AKT、mTOR、STAT5、cyclinD1表达量均增加,细胞增殖能力增强。结果表明,在人乳腺上皮细胞中,miR-142-3p的沉默使PRLR蛋白表达量升高,通过调控AKT、mTOR、STAT5、cyclinD1相关通路蛋白而促进乳蛋白质的合成和乳腺上皮细胞的增殖。