不同收集方法对猪卵母细胞体外成熟培养的影响

本实验就猪卵母细胞的三种采集方法：抽吸法、剖解法和机械破碎法进行了对比研究。结果表明：(1)机械破碎法所采集细胞数目显著高于剖解法(P＜0．05)，剖解法显著高于抽吸法(P＜0．05)；而所用时间则与此相反(P＜0．05)。(2)A级卵母细胞的比例在剖解法中显著高于抽吸法(P＜0．05)，同时抽吸法也显著高于机械破碎法(P＜0．05)。机械破碎法采集的B级细胞比例显著高于其余两法(P＜0．05)；抽吸法所采集的C级细胞也显著高于其余两法(P＜0．05)。(3)剖解法中卵丘扩散率要显著高于其它两法(P＜0．05)；而机械破碎法中第一极体排出率要显著低于另两法(P＜0．05)。     

不同收集方法及添加半胱氨酸、肝素钠对黄牛卵母细胞体外成熟及发育的影响

试验旨在研究不同卵母细胞收集方法及添加半胱氨酸、肝素钠对黄牛卵母细胞体外成熟及体外受精的影响。以黄牛为研究对象,采用两种方法(抽卵法和割卵法)抽取卵泡中的卵母细胞,比较两种方法获取的卵母细胞成熟率,结果发现,抽卵法获得的卵母细胞成熟率显著高于割卵法(P0.05)。将获取的卵母细胞分为4组:A组(对照组,只添加基础成熟培养液)、B组(基础成熟培养液+200μmol/L半胱氨酸)、C组(基础成熟培养液+20μg/mL肝素钠)、D组(基础成熟培养液+200μmol/L半胱氨酸+20μg/mL肝素钠),结果发现,D组的卵母细胞成熟率显著高于A、B、C组(P0.05),B、C组间卵母细胞成熟率无显著差异(P0.05),但两组卵母细胞成熟率均显著高于A组(P0.05);A组卵母细胞卵裂率均显著低于B、C、D组(P0.05),B、C、D组间卵母细胞卵裂率无显著差异(P0.05);D组囊胚率显著高于其他3组(P0.05)。结果表明,抽卵法获得卵母细胞效率显著高于割卵法,肝素钠及半胱氨酸对黄牛卵母细胞体外成熟和体外受精都有促进作用,且同时添加两种物质对体外成熟的效果更佳。     

影响牛卵母细胞体外成熟的因素

本文就牛体外受精的关键环节之一体外成熟,阐述了卵母细胞质量、培养基、激素、生长因子、血清、卵泡液及颗粒细胞对其的影响。     

猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养

实验对猪卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM)以及培养液进行研究。结果表明，在卵母细胞的采集过程中，机械破碎法平均每个卵巢所获得的A、B级细胞数(7.00，20.50)要显著多于抽吸法(1.48，2.73)(P＜0.05)。但抽吸法中平均每个卵巢所用的时间(1.05min)却显著少于机械破碎法(15.6min)(P＜0.05)。NCSU-23与TCM-199两种培养液对卵母细胞体外成熟率无显著差异(P＞0.05)。添加10μg／LrpGH比20μg／LrpGH更有利于卵母细胞的成熟(71.5％，45.5％)，两者差异显著(P＜0.05)。     

不同添加物质对猪卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎工程的重要环节,在体外受精、体细胞核移植及转基因动物等多项操作的早期起决定性作用。IVM技术可有效回收利用屠宰家畜的卵巢,以解决哺乳动物胚胎工程中卵子来源不足的问题。目前,IVM技术已应用于牛、山羊、绵羊、猪等动物的繁殖技术中,并成功获得后代[1],     

不同条件对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究分析了卵巢不同离体时间（＜３ｈ、４～５ｈ、＞６ｈ），不同培养时间（１８～２２ｈ、２３～２４ｈ、＞３０ｈ），不同成熟培养液（添加ＦＳＨ、ＨＣＧ、ＦＣＳ）以及不同培养温度（３４℃、３６℃、３８．５℃）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，小于３小时离体时间成熟率、受精率（７８．８３％、５８．０％）高于其它组；培养时间大于３０小时组成熟率高于其它组（９３．８１％），但受精率低于其它组（２３．０％）；添加ＨＣＧ与ＦＣＳ组成熟率、受精率（８９．４％、７８．９５％）大于ＦＳＨ组；培养温度以３８．５℃为佳，成熟率与受精率（８７．２％、７３．６％）皆高于另二组，差异显著。     

犬卵母细胞体外成熟的影响因素

采集发情期和间情期犬卵巢,回收大腔（直径大于１ｍｍ）卵泡和不可见卵泡的卵母细胞,在４种成熟液（ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ,ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ,ＴＣＭ１９９＋２０％ＥＤＳ和ＴＣＭ１９９＋２０％ＥＤＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ）中成熟后进行了受精试验。结果：（１）发情期大于２ｍｍ和１～２ｍｍ的大腔卵泡卵母细胞的体外成熟率（４２．５％,３２．５％）显著高于间情期卵母细胞（２０．４％）,但发情犬不可见卵泡卵母细胞的体外成熟率（２８．９％）与间情期卵母细胞差异不显著;（２）在成熟液中添加促性腺激素,能有效地提高卵母细胞成熟率,不可见卵泡的卵母细胞对促性腺激素的依赖性（３０．０％比７．８％）大于大腔卵泡的卵母细胞（４２．５％比２９．０％）;（３）卵丘扩散与卵母细胞成熟存在相关性;（４）ＥＤＳ可诱导卵丘扩散,但不能有效提高卵母细胞的成熟率;（５）发情期卵巢上的大腔卵泡和不可见卵泡的卵母细胞以及间情期卵巢不可见卵泡的卵母细胞体外培养后,与体外获能的精子进行体外受精,其卵裂率分别为１６．０％（４／２５）,０％（０／４０）和２．５％（１／４０）。     

半胱氨酸对猪卵母细胞体外成熟、体外受精及GSH水平的影响

体外受精技术也称胚胎生产技术（invitro production,IVP）,包括卵母细胞的体外成熟、精子的获能、卵子的体外受精和受精卵的体外培养等几个连续的过程。半胱氨酸是GSH的前体物质,在牛体外胚胎生产过程中疏基复合物能增加细胞内GSH的合成,在受精和胚胎的开始阶段保持高浓度GSH可以增加发育率。试验的目的是评价半胱氨酸对猪卵母细胞的成熟率、受精率及成熟培养时期卵母细胞内GSH水平的影响,现报道如下。     

不同浓度EGCG对山羊卵母细胞成熟受精的影响

将从屠宰场采回的山羊卵巢在3 h内带回实验室,从卵泡中抽取卵母细胞,取外观形态正常的卵母细胞分成5组,分别添加0、10、15、20、25 μmol/L浓度的EGCG经27 h体外成熟培养后受精,探索不同浓度EGCG对山羊卵母细胞成熟和受精的影响.结果表明EGCG添加浓度为15 μmol/L时对卵母细胞的成熟和受精都有明显的促进效果.     

牛卵泡卵体外成熟及其受精能力的研究

本试验主要研究了牛卵泡卵体外成熟、体外受精及其受精过程的发生。从屠宰场收集800枚牛卵泡卵进行体外成熟培养,并用体外获能的精子体外受精。在用m-TCM199培养21、22、24、26、28h后,达到中期Ⅱ的卵母细胞比例分别为33.89％、74.16％、77.78％、86.67％、85.71％;25h后,如果继续培养,成熟的卵母细胞比例不再显著增加。卵母细胞的自身形态显著地影响其成熟效果,A、B、C级卵培养24h后分别有94.60％、55.43％、31.25％的卵母细胞达到中期Ⅱ。卵泡卵在体外滞留8h后,其成熟率(47.11％)明显地低于45min(77.92％)或4h(74.60％)。肝素和钙离子载体A 23187都能诱发牛精子获能,二者在受精效报上差异不显著(P>0.05),并且都有多精入卵现象发生。授精后6h精子进入卵内,精子入卵后2～3h头部膨大,6h后出现早期原核,最早发生卵裂是在授精后30h。     

不同采卵方式对绵羊卵母细胞质量、体外成熟及体外受精的影响

随着胚胎工程及胚胎相关技术的发展,绵羊卵母细胞和绵羊胚胎的需求量日益增加.获得尽可能多的结合型卵母细胞是体外受精的关键环节.本试验通过剖切法和抽吸法两种不同采卵方式获取卵母细胞并进行体外成熟培养.剖切法获得的卵母细胞数量高于抽吸法,所用时间相差不大.A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法(P＜0.05),抽吸法所采集的C级卵母细胞显著高于剖切法(P＜0.05);剖切法中卵丘扩散率和第一极体排出率要显著高于抽吸法(P＜0.05),受精后不同时期胚胎的发育率差异不显著(P＞0.05).表明剖切法是采集绵羊卵母细胞的理想方法.     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、20...     

猪卵泡卵母细胞的体外成熟与体外受精

本试验对猪卵泡卵母细胞不同体外成熟培养时间、不同精子获能时间、不同精卵共孵育时间对体外受精的影响进行了研究。结果表明,体外成熟培养44 h左右,精子获能时间在1～2 h之间,精卵共孵育时间在6～8 h之间,受精后卵裂率最高。     

藏红花素对小鼠卵母细胞体外成熟能力的影响

试验旨在探讨藏红花素（crocin）的抗氧化应激作用对小鼠卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。在体外成熟（IVM）培养液中添加不同浓度藏红花素（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L）,小鼠卵母细胞在体外成熟培养12 h后,检测卵母细胞第一极排出情况、卵母细胞胞质内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量,并进行体外受精（IVF）;体外受精后6 h统计受精率,24 h统计卵裂率,96 h统计囊胚率。结果显示,与对照组相比,10、15 μmol/L藏红花素显著提高了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）;当藏红花素浓度继续增加时,卵母细胞的第一极体排出率下降,30 μmol/L藏红花素显著降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）;5、10、15 μmol/L藏红花素均显著降低了卵母细胞ROS含量（P<0.05）,10、15 μmol/L藏红花素均显著提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）。与对照组相比,10 μmol/L藏红花素组受精率、卵裂率、囊胚率差异均不显著（P>0.05）,15、20、25、30 μmol/L藏红花素均显著降低受精率和囊胚率（P<0.05）,对卵裂率影响不显著（P>0.05）。结果表明,在小鼠卵母细胞体外成熟培养液中添加10 μmol/L藏红花素可以显著增加第一极体排出率,显著降低卵母细胞ROS含量、提高卵母细胞GSH含量,但对受精后的胚胎发育无显著影响。     

没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在研究没食子酸（gallic acid,GA）对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液（M液）中添加不同浓度没食子酸（0、10、30、50、100 μmol/L）,成熟22~24 h后,统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率;同时,对成熟的卵母细胞进行正常体外受精（IVF）,统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果,选择最优浓度,使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24 h后,检测其细胞内的活性氧水平（ROS）和总谷胱甘肽（TGSH）含量。结果显示,M液中添加30 μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组（0 μmol/L）（P<0.05）,其他处理组与对照组无显著差异（P>0.05）;成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养,其中10和30 μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100 μmol/L组（P<0.05）,50和100 μmol/L组分裂率较对照组也有所提高,但差异不显著（P>0.05）;早期囊胚率统计发现,与对照组相比,30和100 μmol/L能够显著提高囊胚发育率（P<0.05）,10和50 μmol/L浓度组则无显著差异（P>0.05）;与对照组相比,30、100 μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数（P<0.05）;但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异（P>0.05）;对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时,发现30 μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平（P<0.05）,且显著提高总谷胱甘肽含量（P<0.05）。综上所述,在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平,提高总谷胱甘肽含量,进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

牛卵母细胞体外受精和体外成熟技术

文章从卵母细胞的来源、精子体外获能、卵母细胞体外成熟、体外受精和体外受精早期胚胎培养五个方面综述了牛卵母细胞体外受精和体外成熟技术的研究进展.同时指出了影响精子体外获能的因素、影响卵母细胞成熟培养的因素、体外受精存在的问题及解决办法等.并且对影响该技术的主要因素进行了系统分析.     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。