牦牛和犏牛睾丸CPT1a和ETHE1基因mRNA水平比较研究

试验旨在探索牦牛杂交雄性不育后代(犏牛)睾丸脂肪酸氧化特点及其与雄性不育的关联性,阐明犏牛雄性不育的分子机制。以GAPDH和18SrRNA基因为双内参,建立了牦牛和犏牛肝脏型棕榈酰肉碱转移酶1a(CPT1a)和硫双加氧酶1(ETHE1)基因mRNA水平的实时荧光定量PCR检测方法,结果发现,该实时荧光定量PCR方法扩增特异性好,扩增效率为98.5%~107.8%,标准曲线线性关系好。采集成年牦牛(n=9)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸和附睾,通过常规组织切片和HE染色检测,证实犏牛睾丸和附睾中无精子,而牦牛睾丸和附睾中有精子。试验进一步从牦牛和犏牛睾丸中提取总RNA,测定睾丸中CPT1a和ETHE1基因的mRNA水平,结果显示,犏牛睾丸中CPT1a和ETHE1基因mRNA水平分别显著和极显著高于牦牛(P0.05;P0.01)。CPT1a基因mRNA水平的提高表明犏牛睾丸中脂肪酸β-氧化能力的加强;而ETHE1基因mRNA水平的增加可促进线粒体呼吸链的电子传递和脂肪酸氧化,或影响其他能量代谢通路,这两种基因mRNA水平的提高均有助于睾丸脂肪酸的β-氧化供能。本研究结果表明,与牦牛睾丸相比,雄性不育犏牛睾丸的脂肪酸氧化供能水平加强,可能对脂肪酸燃料分子有更多的依赖性。     

牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP 3基因mRNA表达水平研究

本文采用RT-PCR和荧光定量PCR对牦牛SYCP3基因的组织表达,以及SYCP3基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行分析。结果表明,SYCP3基因在牦牛睾丸组织中特异表达,牦牛与犏牛睾丸组织中SYCP3基因的表达水平差异极显著（P〈0．01）。睾丸和附睾组织切片显示,牦牛睾丸组织中可见各级生精细胞,附睾内可见发育良好的精子,而犏牛睾丸组织中无次级精母细胞和更高级生精细胞、附睾内未观测到精子,与人和小鼠SY-CP3基因缺失或表达水平降低出现的表型一致,可以认为SYCP3基因的表达水平可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达水平

Boule基因是DAZ家族成员之一,在生殖细胞中特异表达是精子发生过程中减数分裂的关键调控因子,其表达缺乏可引起减数分裂阻滞和精子生成障碍,导致雄性不育。为揭示Boule基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系,本研究利用实时荧光定量PCR法,对黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达进行定量分析。结果表明:Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平相对都比较高,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05);而Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平显著高于犏牛,黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Boule基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关,可作为研究犏牛雄性不育的重要候选基因。     

麦洼牦牛XDH和BTN1A1基因哺乳期表达分析

为了鉴定牦牛乳脂肪滴形成和分泌相关的黄嘌呤脱氢酶(XDH)、嗜乳脂蛋白亚家族成员1(BTN1A1)基因全泌乳期的表达状况,产犊前15天和产犊后第1,15,30,60,120,240天采集5头麦洼牦牛乳腺组织样品,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析XDH、BTN1A1基因全泌乳期表达变化以及它们与牦牛泌乳的关系。结果表明:牦牛乳腺BTN1A1基因在泌乳的第30天和第120天有2个表达峰,最大峰值出现在产犊后的第30天;XDH基因在泌乳的第30天出现峰值。XDH、BTN1A1基因在产犊后30～120 d的表达水平与产犊前15天相比差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01),说明XDH、BTN1A1基因在牦牛产犊后30～120 d维持较高水平并稳定表达。     

GSTM3基因在牦牛和犏牛睾丸及附睾组织中的表达研究

谷胱甘肽S-转移酶Mu 3(GSTM3）是一种必需的抗氧化酶,其在精子中的存在与精子的耐冷性、质量和生育能力有关。为研究GSTM3的表达与雄性牦牛繁殖功能的关系,本研究对牦牛附睾GSTM3基因进行克隆、生物信息学分析,并应用实时荧光定量PCR分析GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中的表达情况。结果表明,牦牛GSTM3基因CDS区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸;GSTM3基因编码蛋白为弱酸性且不具有跨膜结构,分子式为C1204H1857N319O340S19,分子量和等电点分别为26.85 ku和7.29;牦牛GSTM3核苷酸序列与普通牛和瘤牛有较高的种间同源性,分别为99.26%和98.53%;GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中均有不同程度的表达,牦牛附睾和睾丸的GSTM3表达量显著高于犏牛。     

牦牛和雄性不育犏牛睾丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代谢相关酶活力的比较

本研究旨在测定牦牛表皮细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP5)和睾丸型脂肪酸结合蛋白(FABP9)基因序列,比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的表达,并结合睾丸中部分能量代谢相关酶的活力分析,以探索这两个基因及能量代谢与犏牛雄性不育之间的联系。试验从牦牛睾丸中提取总RNA,采用PCR方法获得了牦牛FABP5和FABP9基因的cDNA序列,编码区长度分别为408和399bp,与普通牛相比分别有1个和6个碱基差异,后者导致FABP9基因推导的氨基酸序列存在5个氨基酸差异。实时荧光定量PCR分析显示,FABP5基因在犏牛睾丸中的表达量极显著大于牦牛,而FABP9基因表达量差异不显著。犏牛睾丸中异柠檬酸脱氢酶活力极显著高于牦牛(P0.01),而β-羟脂酰CoA脱氢酶和乳酸脱氢酶活力与牦牛接近。犏牛睾丸中FABP5基因表达上调以及参与三羧酸循环的柠檬酸脱氢酶活力提高,可能提示雄性不育犏牛睾丸组织在脂肪酸氧化供能水平上高于成年牦牛。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响

旨在研究小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响。将30只SD大鼠随机分成XFM组(M组)和生理盐水对照组(C组),M组又按照时间点的不同分为4个亚组。各组大鼠到达试验设计时间点后分别采取脑组织并分离各脑区,采用PCR和Western blot技术,分别检测各试验组中大鼠不同脑区LKB1基因mRNA的相对表达量和p-LKB1蛋白表达量。结果显示:在试验的麻醉早期阶段(即M1和M2),各脑区LKB1基因mRNA转录与对照组相比均未出现显著变化(P0.05);大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较并无显著变化(P0.05),而丘脑与脑干p-LKB1蛋白表达与对照组比较则明显升高,且丘脑差异显著(P0.05),脑干差异极显著(P0.01)。而在麻醉后期阶段(即M3和M4)各脑区LKB1基因mRNA转录表达明显上升,尤以M4突出,差异极显著(P0.01),其中丘脑和脑干变化最为明显;大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较均无明显变化(P0.05),但丘脑和脑干p-LKB1蛋白表达呈现显著升高(P0.05)。研究表明,XFM麻醉作用可能影响大鼠中枢神经系统中LKB1基因mRNA的转录和p-LKB1蛋白的表达。     

CTGF和FGF-2在不同年龄牦牛肺内的分布与表达研究

采用免疫组织化学(IHC)、蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量(qRT-PCR)检测方法对初生、幼年、成年及老年牦牛肺中CTGF和FGF-2的准确分布位置及其表达量进行研究.IHC结果显示,CTGF主要分布于终末细支气管黏膜上皮克拉拉细胞和管壁平滑肌细胞,肺动脉内皮细胞以及中膜平滑肌细胞;且在初生组...     

不同GI与CBI组合饲粮对牦牛瘤胃和直肠细菌区系的影响

【目的】本研究通过探讨不同粗饲料分级指数(GI)与碳水化合物平衡指数(CBI)组合饲粮对牦牛瘤胃和直肠细菌区系的影响,旨在为舍饲牦牛营养物质消化吸收的调控以及饲粮合理配制提供参考。【方法】选取3.5岁健康、体重相近的公牦牛12头分为3组,即玉米青贮-苜蓿干草-精料组(CAC组)、玉米青贮-小麦秸秆-精料组(CWC组)、玉米青贮-燕麦干草-精料组(COC组)。3组试验牛均采用全混合饲粮方式进行饲喂,试验期为28 d。试验结束时采集瘤胃液和直肠粪样,应用16S rRNA测序技术分析瘤胃和直肠细菌区系变化情况。【结果】对于瘤胃,(1)3组牦牛瘤胃细菌区系的Chao1指数、Ace指数、Simpson指数和Shannon指数差异均不显著(P>0.05);(2)PCoA分析结果显示,CAC与COC组的瘤胃细菌区系有明显的PC1差异(P<0.05);(3)在门水平上,CWC组牦牛瘤胃放线菌门与CAC、COC组存在显著差异(P<0.05);在属水平上,3组牦牛瘤胃细菌区系差异不显著(P>0.05);(4)瘤胃细菌基因功能预测结果显示,复制与修复、原核细胞群体、细胞信号传递、环境...     

牦牛KAP1家族基因长度多态研究

试验旨在研究牦牛角蛋白关联蛋白1（keratin associated protein 1,KAP1）家族基因长度多态与重复序列特点。研究对牦牛和黄牛KAP1家族基因进行测序,并与绵羊已知序列进行比较分析。结果发现,牛KAP1家族位于19号染色体,根据绵羊KAP1家族基因在染色体上的位置与相似性,重新命名了牛KAP1家族基因B2D、B2A、KAP1-1和B2C为KAP1-4、KAP1-1、KAP1-2、KAP1-3（按照染色体上的基因顺序）。KAP1家族基因之间在3'和5'端区域高度保守,中间有重复序列长度差异,其中牦牛KAP1-KAP4基因发现有30 bp的长度多态。研究其蛋白序列发现5个氨基酸为基序的重复序列B（CCQTS）A₁（CCQPT）,以及一个新的重复序列C（SIQTS）。本研究结果说明重复序列是KAP1家族基因间和基因内的主要差异区域,这可能与其角蛋白结合螺旋数相关。     

Study on Length Polymorphism of KAP1 Family Genes in Yak (Bos gurnniens)

This study was aimed to understand the characteristics of length polymorphism with repeat sequence of keratin associated protein 1 (KAP1) family genes in yak. KAP1 family genes of yak and cattle were sequenced, and compared with sheep KAP1 family gene sequences. The results showed that cattle KAP1 family genes were located in chromosome 19, according to location of sheep KAP1 family genes in the chromosome and similarity with cattle KAP1 family genes, renaming the cattle KAP1 family (according to the gene location of chromosome) B2D, B2A, KAP1-1 and B2C genes into KAP1-4, KAP1-1, KAP1-2 and KAP1-3 gene, respectively. KAP1 family genes in the 3'and 5' flank were highly conserved, the difference between family genes mainly in the the repeat sequence region, which yak KAP1 to KAP4 genes were found 30 bp length polymorphism. There were B(CCQTS)A₁(CCQPT) repeat sequence and a new repeat sequence C(SIQTS). The results indicated that the repeat sequence was the key of the polymorphism of KAP1 family genes, which might be relate to combination with keratin protein.     

冷应激条件下猪脂肪组织中脂联素及其受体 mRNA水平的表达变化

为了研究冷应激对脂肪代谢的影响,本试验分别在-15~-10 ℃、-10~-5 ℃、-5~0 ℃、15~18 ℃温度条件下采取猪颈部、背部皮下和内脏系膜脂肪组织,通过荧光定量RT-PCR方法检测脂联素及其受体mRNA的表达水平。结果显示,随着冷应激强度的逐渐加大,在颈部、背部皮下、内脏系膜Adiponectin mRNA的表达量逐渐降低,差异显著(P＜0.05);内脏系膜中AdipoR 1和AdipoR 2 mRNA表达量先逐渐升高后恢复正常,且差异极显著(P＜0.01);背部皮下AdipoR 2 mRNA表达量先逐渐降低后恢复正常,差异极显著(P＜0.01),AdipoR 1 mRNA表达量没有明显变化;颈部皮下AdipoR 2 mRNA的表达量先逐渐升高后恢复正常,差异极显著(P＜0.01),AdipoR 1 mRNA的表达量先升高后恢复正常,而后又升高,差异极显著(P＜0.01)。结果表明,脂联素及其受体参与冷应激过程,它们可能与冷应激条件下脂肪组织的重新分布有重要的关系。     

不同硒浓度日粮对小鼠肝脏和睾丸组织中部分硒蛋白mRNA水平的影响

选取80只7周龄雄性BALB/c小鼠,随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,每组20只,使Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组基础日粮中硒含量达到0.045、0.1、0.4和0.8 mg/kg。结果表明:①Ⅰ组能显著降低小鼠肝脏中硒的沉积量(P<0.05);②Ⅰ组谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPx1)的mRNA相对表达量明显低于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ组在肝脏中差异显著(P<0.05),在睾丸中差异不显著(P>0.05);③Ⅰ、Ⅲ组肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)的mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05),但均显著低于Ⅱ组(P<0.05),而各试验组间在睾丸中差异均不显著(P>0.05);④随着日粮中硒添加量的增加,肝脏和睾丸中硫氧还蛋白还原酶2(thioredoxin reductase 2,TrxR2)的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。因此,在肝脏和睾丸组织中,饲喂低硒饲料能显著降低硒的沉积量和GPx1、GPx4、TrxR2的mRNA相对表达量(P<0.05);而饲喂高硒饲料能显著降低GPx1的mRNA相对表达量(P<0.05),同时显著增加TrxR2的mRNA相对表达量(P<0.05)。提示,硒对GPx1、GPx4和TrxR2 mRNA相对表达量的调节存在组织差异性。     

牦牛隐性乳房炎主要病原菌及耐药和毒力基因分布情况

为探明牦牛隐性乳房炎（SCM）主要病原菌及其耐药和毒力基因的分布情况,本研究自甘肃省甘南州夏季牧场收集无乳房炎临床症状牦牛乳样,通过兰州乳房炎试验（LMT）筛选SCM乳样,从中分离病原菌并纯化培养,利用16S rDNA鉴定主要病原菌,通过纸片扩散法判定其药物敏感性,并采用PCR方法对相关耐药及毒力基因进行检测。结果显示,共筛选出牦牛SCM乳样324份,检出率14.43%;主要病原菌为葡萄球菌属、埃希氏菌属和肠球菌属,其中葡萄球菌分离株对青霉素和四环素耐药率最高,分别为59.57%和47.52%;大肠埃希氏菌分离株对四环素和氨苄西林耐药率最高,分别为43.40%和20.75%;粪肠球菌分离株对四环素和红霉素耐药率最高,分别为25.00%和16.67%;59株耐青霉素金黄色葡萄球菌中共检出MRSA 12株,其中7株携带mecA基因,5株含mecC基因;四环素外排泵基因tetK、tetA携带率最高（85.45%、56.36%）,核糖体保护基因tetM携带率最低（34.55%）;毒力基因中,clfA、clfB、fib、coa基因检出率较高（87.64%、84.27%、83.15%、82.02%）。研究表明,牦牛SCM的主要病原菌为金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌,均对青霉素类和四环素类抗生素耐药性较高,其中金黄色葡萄球菌的主要毒力因子为黏附因子和凝固酶。     

黄曲霉毒素B_1与M_1对小鼠肠道细菌多样性的影响

试验旨在研究黄曲霉毒素B_1与M_1(AFB_1与AFM_1)对小鼠肠道细菌多样性的影响。选取体况良好的4周龄ICR(CD-1)雄性小鼠40只,随机分成4组,每组10个重复,每个重复1只小鼠,其中AFB_1组小鼠每只每天灌胃0.3mg/kg体重AFB_1,AFM_1组小鼠每只每天灌胃3.0mg/kg体重AFM_1,AFB_1+AFM_1组每只每天灌胃AFB_1与AFM_1的混合溶液,其中AFB_1终浓度0.3mg/kg体重,AFM_1终浓度3.0mg/kg体重,以上3组毒素溶剂均为1.0%二甲基亚砜水溶液。对照组小鼠每只每天灌胃1.0%二甲基亚砜水溶液。每只灌胃剂量均为200μL,每天09∶00灌胃一次,连续灌胃28d。灌胃结束后,处死并解剖小鼠,收集结肠内容物,采用16SrRNA测序的方法对肠内容物细菌多样性进行测序分析。结果显示:在细菌群落的门水平、科水平及属水平,与对照组相比,3个毒素处理组小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化(P>0.05),但不同的毒素处理仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化:与对照组相比,AFB_1组及联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia、Staphylococcus、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(P<0.05);而AFM_1组与对照组相比未见显著差异(P>0.05)。综合试验结果,AFB_1单独作用或与AFM_1联合作用可诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌细菌增殖,改变肠道健康微生物区系,损伤肠道微生物屏障功能。     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组）,牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平;采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平;体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h,SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05）,而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加,卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）;添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05）,而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后,SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05）,但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）;INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05）,但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后,SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）;卵母细胞体外培养36 h后,INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明,SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟,在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂,有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化,同时改善早期胚胎的发育能力。     

G蛋白偶联受体50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究

试验旨在研究G蛋白偶联受体50（G protein-coupled receptor 50,GPR50）在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点（0~24 h）纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期（germinal vesicle,GV）、生发泡破裂期（germinal vesicle break down,GVBD）、第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）与第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期（P<0.01）。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。