应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

应用抑制差减杂交法分离玉米幼苗期叶片土壤干旱诱导的基因

 【目的】分离土壤干旱胁迫条件下玉米幼苗期叶片诱导表达的基因。【方法】本研究利用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）的方法，以耐旱自交系CN165为材料，构建了土壤干旱胁迫下玉米幼苗叶片的正向抑制差减cDNA文库。【结果】在这个文库中，随机挑取了672个阳性克隆，并进行PCR验证，对所有的单克隆进行了测序。得到了598个有效序列，经过EST聚类分析后，共得到了80个uniESTs。其中57个为contigs。23个为singlets。BLASTN的结果表明，所有的uniESTs都可以在玉米的核酸数据库中找到同源序列。BLASTX的结果表明：68个uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性，8个uniESTs为未知功能蛋白和假定蛋白，4个uniESTs没有蛋白质的相似性。【结论】在这个cDNA文库中发现了大量抗旱相关的基因，这些基因涉及到植物代谢的多种途径。     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714 bp,包含261 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3 ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实,以及适温条件下有籽的子房和果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆;测序、序列拼接后,共获得1 248个高质量的unigenes;将其与非冗余数据库BLAST比对后,有1 109个unigenes找到同源序列,139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释,其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条,分析表明,茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部,单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库,获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes,包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。     

用链球菌疫苗免疫罗非鱼前后其差异表达基因的鉴定与分析

采用抑制性差减杂交技术（SSH）成功构建了罗非鱼O reochrom is nilotica被链球菌Streptococcus iniae疫苗免疫前后正、反两个淋巴细胞cDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的淋巴细胞基因,并对文库进行了斑点杂交筛选、测序和ESTs初步分析。结果表明：文库富集了高丰度的差异表达基因,阳性率较高。正向文库中筛选得到21个免疫期间表达丰度上调的基因,其中1个基因与罗非鱼已知基因具有相似性,10个基因与其他鱼类已知基因相似,1个基因与其他物种已知基因具有相似性,9个为未知新基因;负向文库中筛选得到24个免疫期间表达丰度下调的基因,其中3个与罗非鱼已知基因具有相似性,15个与其他鱼类已知基因相似,6个为未知新基因。进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度升高,提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度降低,可以降低机体感染和发病几率。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

胞囊线虫侵染后小粒黑豆抑制消减杂交cDNA文库的构建及EST分析

【目的】研究胞囊线虫侵染后大豆根部早期基因表达情况,从分子水平探索大豆的抗病机制。【方法】以抗大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）3号生理小种的小粒黑豆（Glycine max）为材料,利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术,构建大豆胞囊线虫诱导大豆根部早期表达的SSH-cDNA 文库,并结合反向Northern斑点杂交筛选阳性克隆。【结果】获得280个表达序列标签（EST）,经 CAP3 软件聚类拼接,得到166个unique EST,在GenBank进行Blastn与Blastx同源比对,有119条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的83%,已知基因功能的EST涉及信号识别和传导、能量与物质新陈代谢、膜及转运、木质素和类黄酮的生物合成、抗病防御、细胞保护和转录调控。【结论】本研究在大豆胞囊线虫侵染早期发现了表达频率较高的基因如过氧化氢酶、泛肽素、几丁质酶、脂肪氧合酶、水通道蛋白、成熟调控蛋白、金属硫蛋白、脂膜嵌入蛋白、细胞色素P450和3-磷酸甘油醛脱氢酶等,并推测这些基因在大豆与胞囊线虫的非亲和互作过程中起重要作用。     

半番鸭羽色相关基因均一化差减文库的构建和鉴定

【目的】分离半番鸭羽色相关基因,探索半番鸭羽色基因表达调控的分子机制。【方法】以半番鸭白羽皮肤和黑羽皮肤分别作为试验组（tester）和驱动组（driver）,利用双链特异性核酸酶（duplexspecific nuclease,DSN）介导的均一化消减杂交方法,构建半番鸭羽色相关基因消减cDNA文库,同时采用实时荧光定量PCR方法对文库质量进行验证。【结果】①从文库中随机选取144个阳性克隆进行测序分析,最终共获得64条有效序列,平均长度为1 031 bp;经BLAST比对发现,21条具有同源序列,且同源性平均为92.8%;43条未找到匹配序列,推测可能为羽色相关新基因;②Geneontology功能分析表明,已知基因参与信号转导、细胞结构、物质转运、细胞凋亡、细胞与机体防御、转录与表达调控等诸多生物学过程,并且与色素形成和转运存在不同程度的相关性。【结论】经实时荧光定量PCR鉴定后,所建文库质量良好,能够有效地富集白羽皮肤特异表达基因。     

梨小食心虫滞育与非滞育幼虫抑制性消减文库的构建与分析

【目的】分离和鉴定梨小食心虫（Grapholita molesta（Busck））滞育相关基因。【方法】分别以梨小食心虫滞育和非滞育幼虫为材料,通过抑制性消减杂交技术（SSH）,构建梨小食心虫滞育与非滞育正、反向差减cDNA文库,从中筛选梨小食心虫滞育相关基因,并对其进行测序和分析。【结果】在获得的128个滞育特异和132个非滞育特异的EST中,有滞育差异表达EST 42条（17条功能未知）、非滞育差异表达EST 46条（22条功能未知）。对差异表达EST同源检索后推测,其功能大部分与滞育或非滞育特性相关。在滞育个体中,代谢酶和滞育关联蛋白基因表达量较高;在非滞育个体中,贮存蛋白和信号传递基因表达量较高。【结论】这些EST基本反映了梨小食心虫在滞育与非滞育期间的基因表达谱,为今后深入研究梨小食心虫滞育的分子机理奠定了基础。     

中国美利奴超细型与哈萨克羊毛囊兴盛期皮肤组织消减cDNA文库的构建

【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因,为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库,并对差异基因进行测序和生物信息学分析;应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs,其中分别包括5和4个未知功能的ESTs,推测可能是新基因;对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析,结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异;②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达,其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍,而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库,初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。